热细胞梭菌乳酸脱氢酶的工程改造：对其酶催化特性和细菌代谢的影响

《International Journal of Biological Macromolecules》：Engineering of Clostridium thermocellum lactate dehydrogenase: Effects on enzyme catalytic properties and bacterial metabolism

研究不同乳酸脱氢酶（LDH）突变体对产乳酸的影响，发现S161R和I40R突变体显著提高产率，其中I40R突变体表现出更高的产乳酸能力，并分析其酶活性调控机制，如NAD+和GDP的抑制效应，为降低生物乙醇成本提供新策略。

　　在当前的研究中，科学家们关注了一种名为 *Clostridium thermocellum* 的微生物，该微生物被广泛认为是将廉价的纤维素生物质直接发酵为乳酸（LA）的有前景的生物体。乳酸因其在食品、化妆品、制药行业以及生物可降解塑料（如聚乳酸，PLA）生产中的广泛应用，成为市场上需求量最大的有机酸之一，仅次于己二酸。然而，目前工业上生产乳酸主要依赖于纯糖或淀粉作物的发酵，这不仅增加了生产成本，还对环境和资源造成一定负担。因此，探索利用纤维素生物质直接发酵生产乳酸的方法，成为降低生产成本和提升可持续性的关键方向。

*Clostridium thermocellum* 是一种能够高效分解纤维素的厌氧细菌，其独特的代谢机制使其在不进行预处理的情况下，可以直接将纤维素转化为乳酸。已有研究表明，通过基因工程手段，如破坏 *adhE* 基因（编码醛/醇脱氢酶）或增强其乳酸脱氢酶（L-LDH）的表达，可以显著提高 *Clostridium thermocellum* 的乳酸产量。此外，一些研究还指出，通过改变 LDH 酶的催化特性，如提高其对 NADH 或 NADPH 的利用率，也可以进一步优化乳酸的生产过程。

在本研究中，科学家们重点分析了两种经过基因工程改造的 LDH 酶对 *Clostridium thermocellum* 乳酸产量的影响。其中，LDH^S161R 酶由于其对果糖-1,6-二磷酸（FBP）的变构激活能力降低，表现出较高的乳酸产量，相较于野生型 LDH 酶，其产量提高了约 32%。而另一种 LDH^I40R 酶则在烟酰胺辅因子结合位点发生了突变，使其能够同时识别 NADH 和 NADPH 作为辅因子，从而将乳酸产量提升至约 53%。这两种酶的改造不仅提高了乳酸的产量，还显著改善了其对多种代谢中间产物的敏感性。

代谢中间产物对 LDH 酶的活性具有重要影响。除了 FBP 外，其他如 NAD⁺、GDP、ATP、PP_i 和 GTP 等分子也被证实为 LDH 酶的活性调节因子。其中，NAD⁺ 和 GDP 对 LDH 酶表现出较强的抑制作用。有趣的是，LDH^S161R 和 LDH^I40R 两种突变酶相较于野生型酶，对 NAD⁺ 的抑制作用更为敏感，这表明它们在代谢调控方面具有一定的优势。此外，LDH^I40R 还表现出对 ATP 的抑制作用较弱，这一特性可能进一步促进了其在乳酸生产中的高效性。

*Clostridium thermocellum* 的代谢过程具有独特的特点，尤其是在其糖酵解途径中。与真核生物不同，该细菌的糖酵解过程依赖于鸟嘌呤核苷酸而非腺嘌呤核苷酸，这使得 GTP 和 GDP 在调节 LDH 酶活性方面可能发挥重要作用。因此，研究者们推测，GTP 和 GDP 可能成为影响 *Clostridium thermocellum* 乳酸产量的潜在调节因子。事实上，已有研究指出，GTP 可能对某些细菌的 LDH 酶产生抑制作用，这表明其在乳酸发酵过程中的作用仍需进一步探究。

在本研究中，科学家们利用多种基因工程技术对 *Clostridium thermocellum* 的 LDH 酶进行改造，并评估了这些改造对乳酸产量的影响。研究者们发现，通过改变 LDH 酶的催化特性，如其对辅因子的偏好性，可以显著提升乳酸的产量。例如，LDH^I40R 酶由于其对 NADH 和 NADPH 的识别能力增强，不仅提高了乳酸的转化效率，还减少了对某些代谢中间产物的敏感性，从而在发酵过程中表现出更高的稳定性。

此外，研究还涉及了不同 LDH 酶在 *Clostridium thermocellum* 中的表达方式。实验表明，无论是通过染色体还是质粒表达，LDH^I40R 酶都能显著提升乳酸产量，且其效率高于野生型酶。这表明，LDH 酶的改造不仅能够改变其催化特性，还可能影响其在细胞内的表达水平和稳定性，从而对整个发酵过程产生深远影响。

研究者们还评估了不同代谢中间产物对 LDH 酶活性的影响。实验发现，NAD⁺ 和 GDP 对 LDH 酶具有较强的抑制作用，而 ATP 和 PP_i 的抑制作用则相对较弱。这种差异可能与不同辅因子的结合方式和代谢途径有关。例如，NAD⁺ 与 LDH 酶的结合可能导致形成非产率的三元复合物，从而影响乳酸的合成效率。而 ATP 的抑制作用则可能与能量代谢的调控有关，这提示在优化乳酸发酵过程中，需要综合考虑多种代谢中间产物的调节作用。

通过这些研究，科学家们不仅揭示了 *Clostridium thermocellum* 的 LDH 酶在乳酸生产中的关键作用，还为未来的生物燃料和生物材料生产提供了新的思路。例如，利用基因工程手段对 LDH 酶进行改造，可能成为提升乳酸产量的有效策略。此外，研究还表明，通过改变 LDH 酶的催化特性，可以显著提高其在纤维素发酵中的效率，这为开发低成本、高产量的乳酸生产方法奠定了基础。

研究者们还提到，*Clostridium thermocellum* 的乳酸生产过程可能受到多种因素的影响，包括其代谢网络的复杂性、辅因子的可用性以及能量代谢的调控。因此，在优化乳酸发酵过程中，需要综合考虑这些因素，并通过系统性的实验设计，评估不同基因工程策略对乳酸产量的影响。此外，研究还表明，通过改变 LDH 酶的结构，可以显著提高其对特定辅因子的识别能力，从而提升乳酸的合成效率。

本研究的成果不仅为乳酸生产提供了新的方法，还为其他生物燃料和生物材料的生产提供了借鉴。例如，通过基因工程手段改变酶的催化特性，可能成为提升生物燃料产量的通用策略。此外，研究还指出，代谢中间产物的调节作用可能对乳酸生产产生重要影响，这提示在未来的发酵工艺优化中，需要更加关注这些中间产物的调控机制。

研究者们还提到，*Clostridium thermocellum* 的代谢途径具有高度的灵活性和适应性，这使其能够适应不同的发酵条件。例如，通过改变 LDH 酶的催化特性，可以优化其在不同底物条件下的活性，从而提高乳酸的产量。此外，研究还表明，LDH 酶的改造可能影响其在细胞内的表达水平和稳定性，这提示在基因工程设计中，需要综合考虑这些因素，以实现最佳的发酵效果。

总的来说，本研究通过分析 *Clostridium thermocellum* 的 LDH 酶在乳酸生产中的作用，揭示了基因工程改造对乳酸产量的积极影响。这些发现不仅为乳酸生产提供了新的策略，还为其他生物燃料和生物材料的生产提供了重要的参考。未来的研究可以进一步探索不同代谢中间产物对 LDH 酶活性的影响，以及如何通过优化代谢网络来提升乳酸的产量。此外，研究者们还建议，通过系统性的实验设计，评估不同基因工程策略对乳酸生产的影响，以实现更加高效和可持续的发酵过程。