多组学整合揭示阿尔茨海默病关键miRNA、免疫炎症与信号通路：为靶向治疗提供新策略

本研究针对阿尔茨海默病(AD)分子机制不明、缺乏有效治疗靶点的问题，通过整合miRNA-seq、RNA-seq和scRNA-seq多组学数据，鉴定出4个关键miRNA（miR-339-3p、miR-28-3p、miR-423-3p、miR-144-5p）及其调控的388个核心基因，发现这些基因显著富集于MAPK、PI3K-Akt等信号通路，并证实候选miRNA组合可降低AD标志物(APP、p-Tau)表达、促进神经元定向分化，为AD的免疫调节与神经再生联合治疗提供了新思路。

　　

随着全球人口老龄化加剧，阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）作为最常见的神经退行性疾病，已成为全球十大死因之一。患者表现为进行性认知功能障碍和记忆丧失，病理特征包括β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积、神经纤维缠结和神经元丢失。目前全球有超过5000万AD患者，预计到2050年将增至1.52亿，给患者、家庭和社会带来巨大负担。尽管近年来AD研究取得重要进展，但其分子机制仍未完全阐明，现有治疗主要侧重于症状缓解和疾病进展延迟，尚无治愈方法。

AD的发病机制复杂，涉及神经退行性变、氧化应激、免疫炎症反应和凋亡等多个生物过程。临床治疗主要依赖胆碱酯酶抑制剂和NMDA受体拮抗剂，这些药物只能暂时改善认知功能，无法阻止疾病进展。近年来研究越来越强调免疫炎症反应和神经退行性变化在AD发病中的关键作用。因此，识别与AD相关的关键基因和信号通路，开发更有效的治疗靶点，对新型治疗策略具有重要意义。

多组学整合分析作为一种强大的高通量筛选工具，对精确识别疾病靶点具有重要意义。这种跨组学方法不仅能捕捉单组学分析可能忽略的差异，还能通过多组学数据集的相互验证提高准确性和可信度。更重要的是，它能识别复杂异质性疾病中的分子变异，为精准医学的推进提供关键支持。

在这项发表于《International Journal of Biological Macromolecules》的研究中，研究人员通过整合多组学分析和实验验证，系统分析了差异表达miRNA和mRNA在AD神经退行性变和免疫炎症反应中的关键作用。

研究采用的主要技术方法包括：整合三个miRNA-seq数据集（GSE46579、GSE155700、GSE239454）的血液样本分析；RNA-seq数据集（GSE270454）的全血样本分析；单细胞RNA-seq数据集（GSE181279）的外周血样本分析；使用TargetScan和miRDB数据库预测miRNA靶基因；通过GO和KEGG进行功能富集分析；利用冈田酸诱导的SH-SY5Y细胞建立AD细胞模型；采用miRNA模拟物和抑制剂进行细胞转染实验；通过qRT-PCR、ELISA和Western blot验证分子表达水平。

2.1. 差异表达miRNA与突触调节和免疫炎症反应密切相关

通过整合三个miRNA-seq数据集（AD组n=65；NC组n=43），去除批次效应后，LIMMA差异分析鉴定出四个显著差异表达的miRNA：miR-339-3p、miR-28-3p、miR-423-3p和miR-144-5p。GO分析显示靶基因主要富集于"突触调节"（如神经发生调节、兴奋性突触、神经元胞体、神经递质运输）、"免疫炎症反应"（如B细胞分化）和"AD致病过程"（如淀粉样蛋白-β结合、tau蛋白激酶活性、粘着斑）等关键术语。KEGG通路分析进一步显示靶基因显著参与MAPK、cAMP和PI3K-AKT信号通路，炎症/凋亡相关通路（如T细胞受体信号通路、p53信号通路）以及阿尔茨海默病信号通路。

2.2. AD患者神经元功能障碍和凋亡通路激活

整合GSE270454数据集（全血样本）进行降维和聚类分析，LIMMA差异分析鉴定出差异表达的mRNA作为整合分析基因集。将候选miRNA的预测靶基因集与RNA-seq中检测到的差异表达mRNA相交，获得725个重叠基因作为候选基因集。GO和KEGG富集分析显示，这些交叉基因在功能和病理上与神经元功能、神经元死亡/凋亡和免疫炎症反应相关，进一步证实了先前的结论。

2.3. 单细胞测序揭示AD患者免疫细胞群体变化

整合AD患者和正常对照外周血单细胞RNA测序数据集（GSE181279，3例AD患者和2例正常对照），UMAP和tSNE分析识别出九个簇（0-8），AD样本主要聚集在簇2，正常样本在簇5。使用SingleR进行细胞类型注释，包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、中性粒细胞、血小板和前B细胞（CD34-）。堆叠图显示AD样本中T细胞比例显著增加，表明炎症加剧可能是对β-淀粉样蛋白等病理物质的免疫反应，可能加剧神经退行性变。相反，NK细胞比例减少表明免疫监视减弱和潜在免疫失调，疾病风险增加。B细胞比例降低意味着体液免疫功能受损，感染易感性增加，神经保护作用减弱，可能加剧神经元损伤和死亡。

2.4. 整合分析揭示AD关键信号通路和作用位点

对388个候选基因进行GO和KEGG富集分析。GO分析显示，在生物过程（BP）方面，关键基因主要富集于T细胞活化调节、B细胞活化调节和神经元死亡调节；在细胞成分（CC）方面，关键基因富集于神经元-神经元突触、神经元胞体和远端轴突；在分子功能（MF）方面，关键基因显著富集于GTP酶结合、p53结合和门控通道活性。KEGG通路分析显示关键基因显著富集于MAPK、PI3K-Akt、AMPK和cAMP信号通路，以及T细胞受体、B细胞受体、NF-κB、TNF和p53信号通路，这些通路在神经保护、免疫反应、细胞增殖、凋亡和炎症中起关键作用。在疾病和功能方面，关键基因显著富集于凋亡、阿尔茨海默病和胆碱能突触。

2.5. 候选miRNA组合使细胞脱离AD病理状态并向神经元命运转变

使用冈田酸（40 nmol/L）处理SH-SY5Y细胞建立AD细胞模型。根据组学分析，AD患者中上调的候选miRNA为miR-339-3p、miR-28-3p和miR-423-3p，而miR-144-5p下调。实验发现单个miRNA治疗无法改善AD细胞形态，而共转染miR-339-3p抑制剂、miR-28-3p抑制剂、miR-423-3p抑制剂和miR-144-5p模拟物（miRNAs Treatment 1）可显著改善疾病状态。到第9天，细胞出现类似于神经元的突触结构，表明潜在功能恢复。相反，转染miRNAs Treatment 2（miR-339-3p模拟物、miR-28-3p模拟物、miR-423-3p模拟物和miR-144-5p抑制剂）加速细胞萎缩和变圆，加剧AD疾病进程。qRT-PCR分析显示，miRNAs Treatment 1组AD标志物（APP、p-Tau、PSEN1、Aβ42、BIN1）显著下调，神经元祖细胞标志物（PAX6、OTX2、FOXG1）显著上调，但神经元标志物（MAP2、NeuN）的上调有限。这些结果通过ELISA和Western blot实验得到证实。将处理9天的细胞转换为神经元成熟培养基继续培养约5天后，细胞表现出典型的神经元形态并表达神经元标志物。

本研究通过多组学分析（miRNA-seq、RNA-seq、scRNA-seq）和实验验证，系统分析了差异表达miRNA和mRNA在AD神经退行性变和免疫炎症反应中的关键作用。在AD患者血液样本中鉴定出具有显著表达差异的miRNA（miR-339-3p、miR-28-3p、miR-423-3p和miR-144-5p），这些miRNA通过调节突触形成、神经元分化、凋亡和免疫炎症通路促进AD发展。单细胞测序分析揭示了AD患者外周血免疫细胞群体的显著变化，T细胞比例增加，NK细胞和B细胞比例减少，表明AD患者存在系统性免疫失调。通过整合多组学分析鉴定出388个关键基因，阐明了AD中神经退行性变与免疫炎症反应之间的相互作用。

实验结果表明，候选miRNA的联合作用显著降低了AD标志物（Aβ42、p-Tau）并诱导神经元祖细胞分化。然而，成熟神经元标志物（MAP2、NeuN）的上调有限，表明细胞命运重编程可能受到表观遗传障碍或缺失微环境信号的限制。有趣的是，当提供合适的神经元诱导和生长环境时，细胞可以表现出神经元形态并表达标志物，这表明miRNA联合作用加上神经元诱导可能具有修复受损神经元和恢复AD神经元功能的潜力。

从方法学角度看，本研究创新性地整合了基于血液的miRNA-seq、mRNA-seq和单细胞RNA-seq数据，克服了单组学分析固有的局限性（如分子覆盖不全、缺乏细胞分辨率）。多个独立数据集的整合也减轻了由样本特异性偏差引起的结论不可靠性。尽管存在这些优势，但本研究有几个局限性值得注意，包括体外发现完全依赖于单一的细胞模型、 exclusively使用外周血样本、样本队列特征未完全分层、 miRNA介导效应的分子机制未完全阐明以及缺乏体内验证。

这些局限性强调需要后续研究使用更生理相关的模型、具有详细临床元数据的分层大队列以及深入的机制和体内实验。尽管如此，它们并不削弱研究的价值：我们的发现确定了AD发病机制中新的miRNA调控网络和免疫细胞特征，并提出了一个整合免疫调节和神经再生的组合治疗框架。展望未来，联合干预策略（如靶向炎症/凋亡同时促进神经元再生）可能更有效地逆转AD复杂的病理网络，代表了未来转化研究的有希望方向。

这项多组学研究揭示了AD发病机制中的miRNA调控网络和免疫细胞特征。鉴定出的miRNA组合（miR-339-3p/28-3p/423-3p抑制剂+miR-144-5p模拟物）在逆转AD样表型和促进神经元命运方面显示出潜力，提供了一个新的治疗框架。研究结果强调了免疫-神经元串扰在AD中的关键作用，并突出了用于靶向干预的通路（MAPK、PI3K-Akt）。虽然需要进一步的体内验证，但这项工作增进了我们对AD机制的理解，并支持开发基于miRNA的组合疗法。