乳糖辅助固定化β-半乳糖苷酶的构建及其转糖基化活性增强机制研究

本文系统研究了以阴离子交换树脂Duolite A568为载体，通过静电吸附与戊二醛交联法固定化Kluyveromyces lactis来源的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）。创新性地引入乳糖辅助策略，使固定化酶相对活性提升至226%，在pH 4.0-10.0范围内保持高活性且循环10次后仍保留80%以上活性。该酶在果糖存在下催化乳糖生成益生元乳糖（lactulose）的转化率达24.92%，显著高于游离酶（16.23%），为功能性乳制品开发提供了高效稳定的生物催化剂。

　　

亮点

本研究开发了一种新型乳糖辅助固定化策略，显著提升了β-半乳糖苷酶的催化性能与操作稳定性，为高效合成功能性乳制品添加剂提供了技术支撑。

材料与化学品

用于高效液相色谱（HPLC）分析的乳糖、乳糖、果糖、D-半乳糖和D-葡萄糖（纯度>95%）购自Sigma-Aldrich公司（美国密苏里州）。分析级乳糖、D-果糖和戊二醛（25%，v/v）购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG，BR级）由Solarbio科技股份有限公司（中国北京）供应。弱碱性阴离子交换树脂Duolite A568由杜邦公司（美国特拉华州）提供。β-半乳糖苷酶（来自Kluyveromyces lactis，活性≥3000 U/g）购于Aladdin工业公司（中国上海）。实验用水为超纯水（18.2 MΩ·cm），所有其他化学品均为分析纯。

吸附与交联法制备固定化β-半乳糖苷酶

本研究通过静电吸附将Kluyveromyces lactis来源的β-半乳糖苷酶固定于Duolite A568离子交换树脂，并辅以化学交联。吸附过程主要依赖酶蛋白离子（-NH₃⁺或-COO^?基团）与载体相反电荷离子间的静电作用，以及氢键和范德华力[43]。如图1a所示，在pH 4.5、酶浓度2.0 mg/mL条件下吸附60分钟，酶吸附率与相对活性达到最优，载体负载量高达~27 mg/g树脂。后续采用0.1%戊二醛交联显著增强固定化酶相对活性至144%（相较于未交联吸附酶）。特别值得注意的是，本研究创新性地在固定化特定阶段引入糖类辅助策略：乳糖辅助交联法表现尤为突出，所得固定化β-半乳糖苷酶（标记为ACP-β-galactosidase）相对活性高达226%。该固定化酶在宽pH范围（4.0–10.0）内保持高活性，且经十次催化循环后仍保留80%以上初始活性，展现出卓越的操作稳定性。进一步在果糖存在下评估ACP-β-galactosidase的转糖基化活性（以乳糖产量为指标），结果显示其乳糖产量达60.45 g/L（转化率：24.92%），显著高于游离酶（39.55 g/L，16.23%）。

结论

本研究通过静电吸附与化学交联法成功将β-半乳糖苷酶固定于Duolite A568树脂，并采用糖辅助固定化策略提升酶性能。与传统亲水性保护剂海藻糖相比，以酶天然底物乳糖作为辅助剂开发的底物辅助固定化策略表现出显著优势：不仅有效维持酶构象稳定性，更通过特异性结合催化中心显著增强转糖基化活性。该策略为构建高性能固定化酶系统提供了新思路，同时通过固定化诱导的酶功能调控为乳糖生物合成开辟了新途径。