核黄素与烟酰胺协同增效通过代谢调控提升费氏丙酸杆菌维生素B12生物合成

本研究针对费氏丙酸杆菌维生素B12生物合成中前体供应不足的问题，通过添加核黄素（RF）和烟酰胺（NAM）前体，结合转录组学分析，发现3 μM RF与27 mM NAM可显著提升B12产量79%，且该调控主要发生于代谢层面而非转录层面，为食品级B12强化提供了新策略。

　　

在追求健康饮食的今天，维生素B₁₂（B₁₂）的足量摄入至关重要，尤其对素食者和老年人而言。这种维生素在人体内参与造血和神经系统功能，但人体自身无法合成，必须从食物或补充剂中获取。传统上，B₁₂主要来源于动物性食品，但随着植物基饮食的兴起，如何通过天然、安全的方式强化食品中的B₁₂成为科研和工业界的热点。费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）作为一种公认安全的（GRAS）微生物，不仅用于奶酪生产，还是潜在的B₁₂生物制造者。然而，天然菌株的B₁₂产率有限，以往常通过遗传工程或直接添加化学前体5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI）来提高产量，但这些方法不符合食品级或清洁标签的要求。因此，探索利用天然维生素前体（如核黄素RF和烟酰胺NAM）来促进B₁₂的生物合成，成为一种有吸引力的替代方案。

尽管先前研究表明RF和NAM可以增强B₁₂产量，但其作用机制尚不明确——究竟是纯粹的营养前体补充，还是涉及基因表达的调控？此外，大多数研究在富含B族维生素的乳清基质中进行，难以区分各前体的独立贡献。为此，由Bhawani Chamlagain等人领导的研究团队选择费氏丙酸杆菌DSM 20271（一株基因组测序的模式菌株）作为模型，在低内源RF和NAM的大麦麦芽提取物基质中，探究了RF和NAM supplementation对B₁₂生物合成的影响，并首次结合RNA测序（RNA-seq）技术，从转录层面揭示了其调控机制。该研究发表于《International Journal of Biological Macromolecules》，为开发食品友好的B₁₂强化策略提供了重要见解。

研究采用了几项关键技术方法：首先，优化了麦芽提取物培养基（ME），通过添加乳酸和胰蛋白胨（ME+L+T）显著提高了菌体生长和B₁₂产量；其次，使用超高效液相色谱（UHPLC）结合紫外或荧光检测，定量了B₁₂、RF、NAM及其代谢物；第三，利用RNA-seq进行转录组分析，比较了补充组（3 μM RF + 27 mM NAM）与对照组的基因表达差异，并通过液滴数字PCR（ddPCR）进行了验证；最后，通过Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）富集分析，解析了差异表达基因的功能和通路。所有实验均包括三个生物学重复，确保了结果的可靠性。

3.1. Optimisation of malt extract-based medium for B12 production

研究人员比较了四种培养基配方，发现添加乳酸和胰蛋白胨的ME+L+T培养基支持最佳菌体生长和B₁₂生产。与基础ME相比，ME+L+T的菌体生物量提高了约40%，B₁₂产量从0.155 μg/mL增加至0.552 μg/mL（3.5倍提升）。这种改善部分归因于乳酸代谢维持了更适宜的pH环境（最终pH 5.3），有利于DMBI的形成和活化。ME+L+T的内源RF浓度为0.17 μg/mL，总烟酸含量为4.4 μg/mL，为后续前体补充实验提供了低背景的基质。

3.2. Effect of riboflavin supplementation on B12 biosynthesis

在固定NAM浓度（27 mM）下，测试了不同RF浓度（1、3和40 μM）的影响。结果表明，B₁₂产量随RF剂量增加而上升：3 μM RF即可显著提高产量41%，而40 μM RF进一步提升至79%。相比之下，直接添加DMBI（100 μM）并未显著增强B₁₂生产。菌体生长参数（如生物量）基本未受影响，说明RF的促进作用并非通过增加菌体数量，而是通过改善前体可用性实现。

3.3. Effect of nicotinamide supplementation on B12 biosynthesis

在固定RF浓度（3 μM）下，测试了不同NAM浓度（0.1、0.6和27 mM）的效果。仅当NAM达到27 mM时，B₁₂产量才出现显著提升（62%），较低浓度则无此效应。生长参数同样变化不大，再次证实B₁₂增强源于代谢层面。值得注意的是，发酵过程中NAM完全转化为烟酸（NA），而NA的安全摄入上限远低于NAM，这为食品应用带来了安全性考量。

3.4. Effect of supplementation on sugar and acid profile

有机酸和糖类代谢分析显示，乳酸和葡萄糖在所有条件下均被完全消耗，果糖则基本未被利用。乙酸和丙酸积累 pattern 一致，且RF或NAM补充未显著改变这一 profile，表明碳源代谢未受前体添加的干扰。

3.5. Riboflavin metabolism

RF消耗监测显示，在未补充组，内源RF浓度从0.17 μg/mL增至0.27 μg/mL，表明菌体自身合成RF。在补充组（1–3 μM RF），绝大部分添加的RF被消耗；但在40 μM RF时，仅少量被利用，提示反馈抑制机制。NAM浓度变化对RF摄取影响微小，说明NAM主要作用于DMBI活化环节。

3.6. GO and KEGG enrichment analysis of DEGs

RNA-seq分析鉴定出509个差异表达基因（DEGs），其中245个上调、264个下调。富集分析发现，下调基因显著富集于“离子跨膜转运”（GO:0034220）、“维生素结合”（GO:0019842）等GO term，以及群体感应（pfr02024）、精氨酸生物合成（pfr00220）等KEGG通路，表明补充策略引发了广泛的代谢重编程。

3.7. Functional interpretation of DEGs

关键发现包括：RF生物合成操纵子（ribB、ribC、ribD）显著下调（2–3倍），证实外源RF引发反馈抑制；B₁₂合成基因转录稳定，表明调控在代谢层面；氮代谢相关基因（如glnK、amtB、glnA）下调，反映营养充裕状态；铁摄取基因（如feoA、feoB）上调，暗示 redox 平衡调整。这些变化共同支持了B₁₂合成的代谢增强。

4. Discussion

研究明确显示，RF和NAM supplementation 通过提高DMBI生物合成和活化效率来增强B₁₂产量，而非改变菌体生长或转录程序。RF在低浓度（3 μM）下即有效，且几乎被完全消耗；NAM则需高浓度（27 mM）才显效，但需注意其向NA的转化可能带来安全隐患。转录组数据证实，B₁₂合成基因无显著表达变化，但RF合成基因受抑制，氮代谢和铁获取途径调整，体现了菌体在资源分配上的优化。

5. Conclusions

本研究确定了3 μM RF和27 mM NAM作为有效浓度，可显著提升费氏丙酸杆菌的B₁₂产量。机制上，该增强源于前体供应的改善和DMBI活化的促进，而非转录调控。对于食品应用，NAM浓度必须控制在安全范围内（如0.25 mM），以避免过量NA摄入。未来研究应聚焦于在安全剂量下优化B₁₂合成策略，例如结合RF或利用菌株特异性优化。

该工作不仅阐明了RF和NAM在B₁₂生物合成中的代谢作用机制，还为开发天然、食品级的B₁₂强化方案奠定了理论基础，具有重要的科学价值和应用前景。