综述：冷藏海鱼腐败微生物风险的前沿研究：从区域到全球视角

本综述深入探讨了利用核黄素（RF）和烟酰胺（NAM）作为前体，在费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）中强化维生素B12（B12）生物合成的策略。研究通过代谢组学与转录组学（RNA-seq）结合，揭示了B12增产主要源于前体可利用性提升（如DMBI合成与激活），而非基因转录调控，为开发安全、高效的B12强化发酵食品提供了重要理论与实践依据。

　　

引言

费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）是一种公认安全的（GRAS）微生物，广泛应用于瑞士型奶酪的生产，不仅贡献于风味形成和特征性“孔眼”结构，更是维生素B₁₂（B₁₂）的重要微生物生产者。在B₁₂的分子结构中，5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI）作为其下环配体，其生物合成以核黄素（RF，维生素B₂）为前体，并在有氧条件下进行，而烟酰胺（NAM，维生素B₃的一种形式）被报道可有效刺激这一生物合成途径。传统的工业策略是在好氧发酵末期外源添加DMBI以提高产量，但这与食品级或清洁标签应用的要求相悖。因此，利用天然维生素前体进行代谢补充，为发酵食品中的B₁₂强化提供了一条充满前景的替代路径。

材料与方法

本研究以费氏丙酸杆菌DSM 20271（一株已完成基因组测序的模式菌株）为研究对象。首先，对以大麦麦芽提取物为基础的模型培养基进行了优化。通过评估四种培养基配方：麦芽提取物基础培养基（ME）、补充乳酸盐的ME（ME+L）、补充胰蛋白胨的ME（ME+T）以及同时补充乳酸盐和胰蛋白胨的ME（ME+L+T），发现ME+L+T能支持最佳的菌体生长和B₁₂产量。该培养基包含10% (w/v)的浓缩麦芽提取物，并添加了乳酸盐和胰蛋白胨。

在优化的ME+L+T培养基中，评估了RF和NAM补充的影响。RF测试了1、3和40 μM三个浓度（同时固定NAM为27 mM），以确定能显著增强B₁₂生产的最低有效RF浓度。随后，测试了NAM的0.1、0.6和27 mM三个浓度（同时固定RF为3 μM）。以不添加任何补充物的培养物以及添加100 μM DMBI的培养物作为对照。

培养在50 mL离心管中进行，内含20 mL培养基，按1% (v/v)接种经活化的菌种，每个条件设置三个生物学重复。RF和NAM在培养第0天添加，而DMBI在第6天补充。培养过程先于30°C厌氧条件下进行3天，随后短暂无菌开口引入氧气，并在200 rpm的摇动条件下继续培养4天。DMBI补充的培养物在补充后继续培养24小时。

培养结束后，测量光密度（OD₆₀₀）和pH值，并通过离心收获菌体细胞和上清液。菌体用于提取并量化胞内B₁₂（采用UHPLC-UV方法），上清液则用于分析残留的RF（采用酸和酶提取后UHPLC-荧光检测法）、NAM和烟酸（NA）（采用基于EN 15652:2009标准的UHPLC方法）以及糖类和有机酸（采用HPLC法）。

为探究RF和NAM对基因表达的影响，在ME+L+T培养基中（添加或不添加3 μM RF和27 mM NAM）培养菌株，并在培养35小时（对数生长中期）取样进行转录组学（RNA-seq）分析。总RNA提取后，经核糖体RNA去除，构建文库并在Illumina NovaSeq 6000平台上进行双端测序（150 bp读长）。测序读数使用Bowtie2比对至参考基因组（GenBank accession no. NZ_CP010341），差异表达分析使用R包DESeq2进行。以调整后p值（padj）< 0.05且|log₂(fold change)| ≥ 1（即表达量变化≥2倍）作为显著差异表达的标准。通过液滴数字PCR（ddPCR）对部分差异表达基因的结果进行了验证。此外，还进行了基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，以阐释差异表达基因的生物学功能。

结果

培养基优化与B₁₂生产

在测试的培养基中，ME+L+T支持了最好的菌体生长（OD₆₀₀和细胞生物量最高）和最高的B₁₂产量。与基础ME培养基相比，B₁₂产量提高了约3.5倍（从0.155 μg/mL增至0.552 μg/mL）。ME+L+T的内源性RF浓度较低（0.17 μg/mL），总烟酸（NAM + NA）含量为4.4 μg/mL。

RF补充对B₁₂生物合成的影响

RF补充呈剂量依赖性地增强了B₁₂的生产。与未补充的对照相比，补充3 μM RF（与27 mM NAM一起）可使B₁₂产量显著提高41%，而补充40 μM RF可进一步提高至79%。相比之下，直接添加100 μM DMBI并未显著提高B₁₂产量。RF补充对最终pH值和细胞生物量没有显著影响，但较高浓度的RF（3 μM和40 μM）导致了OD₆₀₀值的轻微升高。

NAM补充对B₁₂生物合成的影响

只有在最高测试浓度（27 mM）的NAM（与3 μM RF一起）下，才观察到B₁₂产量的显著增强（提高62%）。较低浓度的NAM（0.1 mM和0.6 mM）效果不显著。27 mM NAM也导致了OD₆₀₀值和细胞生物量的轻微增加。

对糖和有机酸谱的影响

在所有发酵条件下，培养基中的乳酸和葡萄糖被完全消耗，麦芽糖浓度基本不变，果糖则大部分未被代谢。乙酸和丙酸在所有条件下均稳定积累。RF、NAM或DMBI的添加对整体的糖和有机酸谱影响甚微。

RF代谢

在未补充的ME+L+T中，上清液中的RF浓度从初始的0.17 μg/mL略微增加至0.27 μg/mL，表明菌体存在内源RF生物合成。当补充1 μM或3 μM RF时，大部分添加的RF被消耗。在补充40 μM RF时，仅有一小部分被利用。在不同NAM浓度（与3 μM RF一起）下，RF的消耗量相对稳定（减少0.7–0.9 μg/mL），表明NAM主要影响DMBI的激活而非RF代谢。

转录组学分析

RNA-seq分析鉴定出509个差异表达基因（DEGs），其中245个上调，264个下调。值得注意的是，与B₁₂生物合成直接相关的核心基因在转录水平上未发生显著变化。然而，RF生物合成操纵子中的基因（ribB, ribC, ribD, ribH）均显著下调（1.4-3.0倍），这与外源RF反馈抑制内源合成相一致。参与四吡咯合成早期途径（兼用于血红素和B₁₂合成）的基因hemL2（谷氨酸-1-半醛氨基转移酶）下调了4.9倍。

氮代谢相关基因广泛下调，包括P-II家族氮调节因子glnK（下调8.1倍）、其相关的铵转运蛋白amtB（下调7.1倍）、谷氨酰胺合成酶glnA（下调3.7倍）以及多个氨基酸转运蛋白基因。这表明在营养充足的补充条件下，氮同化需求降低。此外，参与硫还原（cysI, cysH, cysD）和α-酮戊二酸转运（kgtP）的基因也出现下调。

另一方面，铁获取相关基因显著上调，包括Feo铁转运系统基因（feoA, feoB）和铁-铁载体ABC转运蛋白基因，表明对铁的需求增加。编码支链α-酮酸脱氢酶复合物的bkdA-bkdB-pdhC操纵子（上调3.2-3.9倍）、甘油-3-磷酸脱氢酶glpA（上调2.0倍）和RNase P RNA组分rnpB（上调2.1倍）也出现上调。

GO和KEGG富集分析（针对所有DEGs未发现显著富集项）聚焦于下调基因集后，发现“离子跨膜转运”和“维生素结合”两个GO项显著富集。KEGG分析显示“群体感应”、“精氨酸生物合成”和“丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢”通路富集。

讨论

本研究证实，在低内源RF和NAM的麦芽提取物培养基中，补充RF（≥3 μM）和NAM（27 mM）能显著增强费氏丙酸杆菌DSM 20271的B₁₂产量，且这种增强并非通过增加菌体生物量实现，而是源于前体代谢的改善。

RF被主动消耗，且补充外源RF通过FMN核糖开关介导的反馈抑制机制，强烈抑制了内源RF生物合成操纵子的转录。NAM则在实验中被完全转化为烟酸（NA），后者是BluB/CobT2融合酶催化DMBI激活步骤的关键辅因子。高浓度NAM（27 mM）对DMBI激活的强烈促进作用与先前研究一致。

关键的发现是，尽管B₁₂产量大幅提高，但其生物合成途径的核心基因在转录水平上并未发生显著变化。这表明RF和NAM的增强效应主要发生在代谢层面，包括：（1）提供充足的RF前体用于DMBI骨架合成；（2）通过NAM衍生的NA促进DMBI的激活与 incorporation；（3）可能改善了细胞的氧化还原状态和辅因子平衡。转录组变化整体描绘了一幅在维生素前体充足条件下，细胞减少内源合成负担（如RF、氮同化），并调整资源分配以支持 increased metabolic activity and B₁₂ assembly 的图景。

然而，从食品安全应用角度，高浓度NAM（27 mM，约合330 mg/100 mL）的使用是一个重要考量。因为NAM会转化为NA，而NA的每日可耐受上限摄入量（10 mg/天）远低于NAM（900 mg/天）。因此，在实际食品应用中，NAM的添加量必须远低于本研究中使用的有效实验浓度，以避免消费者摄入过量的NA。未来研究需要探索在生理安全浓度（如~0.25 mM NAM）下，通过与其他策略（如菌株选育、发酵工艺优化）结合，能否有效促进B₁₂合成。

结论

本研究确定了能有效增强费氏丙酸杆菌B₁₂生产的RF（3 μM）和NAM（27 mM）浓度，并阐明其作用机制主要在于代谢水平的前体供应与激活，而非转录调控。研究结果支持了利用食品级维生素前体进行B₁₂强化的策略。然而，鉴于NAM向NA的转化及其相应的膳食安全限值，未来开发B₁₂强化食品时，必须谨慎优化NAM的使用剂量，在追求高效的同时确保其安全性。这为天然、安全、高效的维生素B₁₂生物强化策略提供了重要的见解和方向。