核黄素和烟酰胺协同调控费氏丙酸杆菌维生素B12生物合成的代谢机制研究及其在食品强化中的应用

本研究针对食品级维生素B12生物强化需求，通过优化麦芽提取物培养基并联合补充核黄素（RF）和烟酰胺（NAM），显著提升了费氏丙酸杆菌DSM 20271的B12产量。结合转录组学分析，发现B12合成增强主要源于前体代谢水平调控而非基因转录激活，为天然B12强化食品开发提供了理论依据和实践策略。

　　

维生素B₁₂（B₁₂）是人体必需的水溶性维生素，在DNA合成、神经功能和红细胞形成中发挥关键作用。随着植物基饮食的普及，B₁₂缺乏问题日益凸显，开发天然B₁₂强化食品成为研究热点。费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）作为公认安全的（GRAS）菌株，不仅用于奶酪生产，还是微生物合成B₁₂的重要平台。然而，工业生产中常需外源添加B₁₂的含氮碱基配体5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI），这与食品级清洁标签要求相悖。核黄素（RF，维生素B₂）是DMBI生物合成的前体，烟酰胺（NAM，维生素B₃的一种形式）可促进DMBI的活化，但两者对B₁₂合成的调控机制尚不明确，尤其在食品兼容体系中缺乏系统研究。

为解决上述问题，Bhawani Chamlagain等研究人员在《International Journal of Food Microbiology》发表了题为"The effectiveness of slurry ice for reducing Campylobacter on free-range poultry carcasses"的研究论文（注：根据用户提供文档，实际研究内容为RF和NAM对B₁₂合成的调控，标题与内容可能存在偏差，此处以文档内容为准）。他们通过优化低内源RF和NAM的麦芽提取物培养基，结合生长特性分析、代谢物检测和RNA测序技术，揭示了RF和NAM通过代谢水平而非转录调控增强B₁₂合成的机制，为食品级B₁₂生物强化提供了新策略。

研究采用的主要技术方法包括：1）菌株活化与培养基优化：以费氏丙酸杆菌DSM 20272为模型，在麦芽提取物基础培养基（ME）中评估乳酸和胰蛋白胨添加对生长和B₁₂产量的影响；2）维生素补充发酵：在优化培养基（ME+L+T）中添加不同浓度RF（1-40 μM）和NAM（0.1-27 mM），以DMBI补充为对照，监测B₁₂产量和前体消耗；3）代谢物分析：通过UHPLC-UV和HPLC分别定量B₁₂、RF、NAM/NA及有机酸/糖；4）转录组学：对补充组（3 μM RF+27 mM NAM）和对照组进行RNA测序，结合GO和KEGG富集分析差异表达基因（DEGs），并通过微滴数字PCR（ddPCR）验证关键基因表达。

3.1. 培养基优化促进B₁₂生产

在含10%浓缩大麦麦芽提取物的磷酸缓冲培养基中，补充乳酸和胰蛋白胨（ME+L+T）显著提升了菌体生长（OD₆₀₀提高32%）和B₁₂产量（0.552 μg/mL，较基础ME提高3.5倍）。该培养基内源RF和NAM含量较低（分别为0.17 μg/mL和0.5 μg/mL），为研究外源补充效应提供了理想平台。

3.2. 核黄素补充增强B₁₂合成

在固定NAM浓度（27 mM）下，RF补充呈剂量依赖性促进B₁₂生产：3 μM RF使产量提高41%，40 μM RF进一步提高79%。相反，直接添加DMBI（100 μM）未显著提升产量，表明菌株依赖内源RF合成DMBI。生长参数和有机酸谱未受显著影响，证实B₁₂增加源于代谢前体可用性改善而非生物量增长。

3.3. 烟酰胺仅在高效浓度下有效

固定RF为3 μM时，仅27 mM NAM能显著提升B₁₂产量（62%），低浓度（0.1-0.6 mM）无效。NAM被完全转化为烟酸（NA），提示其通过形成烟酸单核苷酸激活DMBI整合酶（BluB/CobT2）。但27 mM NAM（约330 mg/100 mL）远超食品安全限值（NA上限10 mg/天），限制了直接应用。

3.4. 核黄素代谢与消耗

未补充时培养基RF浓度增加（0.17→0.27 μg/mL），表明存在内源合成。补充RF（≤3 μM）时几乎被完全消耗，而40 μM RF仅部分利用（消耗2.3 μg/mL），反映反馈抑制效应。NAM浓度变化不影响RF摄取，证实NAM主要作用于DMBI活化而非RF代谢。

3.5. 转录组揭示代谢级调控机制

RNA-seq鉴定出509个差异表达基因（245上调/264下调）。关键发现包括：1）RF生物合成操纵子（ribB、ribC、ribD）下调2-3倍，证实外源RF通过FMN核糖开关抑制内源合成；2）B₁₂合成基因转录稳定，仅共享卟啉合成路径的hemL2下调4.9倍；3）氮代谢相关基因（glnK、amtB、glnA等）显著下调，反映营养充足状态下氮同需求降低；4）铁获取基因（feoA、feoB等）上调，可能支持B₁₂合成中钴离子整合。

研究结论表明，RF和NAM通过提供代谢前体和辅助因子激活酶促反应，而非转录调控，增强B₁₂合成。3 μM RF与27 mM NAM组合可显著提升产量，但NAM的安全性问题要求后续研究探索低浓度NAM与RF联用或菌株适配策略。该工作首次在食品兼容体系中解析了维生素前体对B₁₂合成的代谢调控网络，为开发天然B₁₂强化发酵食品提供了理论基础和实践指导。