核黄素与烟酰胺协同调控费氏丙酸杆菌维生素B12生物合成的代谢机制研究及其在发酵食品强化中的应用

本研究针对费氏丙酸杆菌维生素B12生物合成过程中前体物质利用率低的问题，通过优化大麦麦芽提取物培养基体系，结合转录组学分析揭示核黄素（RF）与烟酰胺（NAM）对B12合成的协同促进机制。研究发现3 μM RF与27 mM NAM联用可使B12产量提升62%，且该调控主要发生在代谢层面而非转录水平，为开发食品级B12生物强化技术提供了重要理论依据和实践策略。

　　

在追求健康饮食的当代社会，维生素B₁₂（Cobalamin）的缺乏问题日益凸显，尤其对素食人群和老年群体构成健康威胁。这种唯一含金属元素的水溶性维生素，在神经系统功能和红细胞生成中扮演着关键角色。然而，传统的化学合成法生产的B₁₂难以满足消费者对"清洁标签"食品的需求，这使得微生物发酵法生产B₁₂成为研究热点。其中，费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）作为一种公认安全的（GRAS）菌株，不仅赋予瑞士奶酪独特风味和孔洞结构，更是潜在的B₁₂生物制造者。

但问题在于：如何在不使用基因工程技术的前提下，有效提升费氏丙酸杆菌的B₁₂产量？科学家们将目光投向了B₁₂分子结构的关键组成部分——5,6-二甲基苯并咪唑（DMBI）。这个作为"下配体"的小分子，其生物合成需要以核黄素（维生素B₂）为前体，并在烟酰胺（维生素B₃的一种形式）的辅助下完成活化。尽管前人研究暗示了这两种维生素前体的重要性，但它们究竟是通过调控基因表达还是直接作为代谢底物起作用，仍是一个未解之谜。

为了解决这一科学问题，由Bhawani Chamlagain领衔的研究团队在《International Journal of Food Microbiology》上发表了一项综合性研究。他们建立了一套低本底RF和NAM的麦芽提取物培养基系统，通过精确控制发酵条件并运用RNA测序技术，深入解析了RF和NAM对B₁₂生物合成的调控机制。

研究采用的主要技术方法包括：首先优化基于大麦麦芽提取物的培养基配方，通过添加乳酸和胰蛋白胨增强菌体生长和B₁₂产量；使用超高效液相色谱（UHPLC）结合紫外和荧光检测技术定量分析B₁₂、RF、NAM及相关代谢物；应用RNA测序（RNA-seq）和数字化PCR（ddPCR）分析基因表达差异；通过Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析解析转录组数据。

3.1. 培养基优化促进B₁₂生产

研究人员比较了四种培养基配方，发现添加乳酸和胰蛋白胨的ME+L+T培养基支持最佳菌体生长和B₁₂产量，细胞生物量达到0.256 g/20 mL，B₁₂产量提升3.5倍至0.552 μg/mL。这种改善归因于乳酸代谢维持了更适宜DMBI合成的pH环境（最终pH 5.3）。

3.2. 核黄素剂量依赖性增强B₁₂合成

在固定27 mM NAM条件下，RF补充呈现剂量依赖性效应。3 μM RF即可显著提升B₁₂产量41%，而40 μM RF进一步增加至79%。相反，直接添加DMBI前体并未显著改善B₁₂产出，表明菌体依赖内源性RF生物合成途径。

3.3. 高浓度烟酰胺有效激活B₁₂合成

在固定3 μM RF条件下，仅27 mM NAM能显著增强B₁₂生产（62%提升）。值得注意的是，NAM在发酵过程中完全转化为烟酸（NA），这引发了对其食品应用安全性的考量，因NA的每日可耐受上限摄入量（10 mg/天）远低于NAM（900 mg/天）。

3.4. 代谢物谱分析揭示特异前体利用

糖和有机酸谱分析显示，RF和NAM补充对主要碳源代谢影响微小，乳酸和葡萄糖被完全消耗，而果糖基本未利用。乙酸和丙酸在所有条件下稳定积累，证实维生素前体的效应特异于B₁₂合成途径。

3.5. 核黄素代谢动态监测

RF消耗分析表明，在未补充条件下菌体仍进行RF的生物合成（培养基RF浓度从0.17增至0.27 μg/mL）。低浓度补充RF（≤3 μM）几乎被完全消耗，而高浓度RF（40 μM）仅部分利用，显示反馈抑制机制存在。

3.6. 转录组揭示代谢非转录调控

RNA-seq鉴定出509个差异表达基因（245个上调，264个下调）。引人注目的是，RF生物合成操纵子基因（ribB、ribC、ribD）显著下调2.0-3.0倍，证实外源RF的反馈抑制效应。然而，核心B₁₂生物合成基因保持转录稳定，表明增产非转录层面调控。

3.7. 氮代谢与铁获取通路重塑

氮代谢相关基因广泛下调，包括glnK（氮调节因子，下调8.1倍）、amtB（铵转运蛋白，下调7.1倍）和glnA（谷氨酰胺合成酶，下调3.7倍），反映营养充足条件下的代谢重编程。相反，铁获取基因（feoA、feoB、铁载体ABC转运蛋白）显著上调，提示维生素前体补充可能增强铁依赖性酶活性。

研究结论明确指出，RF和NAM通过代谢层面而非转录调控机制增强B₁₂合成。3 μM RF和27 mM NAM联用可实现B₁₂产量显著提升，这主要得益于改善的DMBI生物利用度和活化效率。然而，高浓度NAM带来的安全性问题要求在实际食品应用中审慎权衡强化效果与摄入安全，建议将NAM用量控制在0.25 mM（约3 mg/100 mL）以下以确保符合膳食安全标准。

该研究的创新价值在于首次在近生理条件下解析了RF和NAM对费氏丙酸杆菌B₁₂合成的协同调控网络，揭示了关键的代谢适应机制，为开发食品级维生素B₁₂生物强化策略提供了坚实理论基础。未来研究方向应包括探索低剂量NAM与其他辅助因子的协同效应，以及通过菌株筛选获得高效利用维生素前体的天然菌株，推动清洁标签功能性食品的开发进程。