通过GST标签融合活性位点背面提升肝素酶II可溶性表达与催化效率的创新策略

本文推荐一项关于肝素酶II（HepII）高效表达与功能强化的创新研究。作者通过将GST标签融合至肝素酶II活性口袋背面，显著提升其在E. coli中的可溶性表达与纯化回收率（70.3%），并证明GST标签使酶对肝素（heparin）和硫酸乙酰肝素（HS）的催化效率分别提高3.1倍和1.4倍。分子对接提示GST可能通过增强蛋白柔性、改变底物通道构象以促进底物结合，为酶工程改造提供新思路。

　　

Highlight

通过将GST标签融合至肝素酶II（HepII）活性位点的背面，显著提高了酶的可溶性表达与催化效率。

Section snippets

Bacterial strains and reagents

重组质粒pET-28a(+)-MaHepII带有来自Mariniphaga anaerophila、经信号肽截短（残基18–759）的肝素酶II基因，由本实验室构建并保存。该基因插入N端BamHI和C端XhoI酶切位点之间，与载体编码的C端6×His标签框内融合以便纯化。大肠杆菌（E. coli）DH5α和BL21感受态细胞、pGEX-6P载体、Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等试剂均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。肝素（来自猪肠黏膜，分子量17–19 kDa）和硫酸乙酰肝素（HS，来自猪肾）购自Sigma-Aldrich（美国）。Ni-NTA树脂和还原型谷胱甘肽（GSH）购自碧云天生物技术研究所（中国）。所有其他化学品均为分析纯。

Sequence analysis of MaHepII

MaHepII源自Mariniphaga anaerophila（NCBI RefSeq: SHE82370.1），编码759个氨基酸。SignalP（v5.0）预测其N端具有17个氨基酸的信号肽，切割位点位于第17和18位残基之间：VTK↓CE。去除该区域后，本研究使用的MaHepII由742个氨基酸组成，理论分子量为84,626.7 Da，预测等电点（pI）为5.35。TMHMM分析表明它不含跨膜结构域。使用SWISS-MODEL进行三级结构同源建模，模板为Pedobacter heparinus来源的肝素酶II（PDB: 2FUQ，序列一致性34.5%）。模型显示MaHepII具有典型的（α/α）6桶状折叠，活性口袋位于桶的内表面。GST标签通过一段柔性连接肽（GGGGS）融合至MaHepII的N端，该位点位于活性口袋的背面，推测可能影响底物通道的构象。

Conclusion

本研究克隆了来自Mariniphaga anaerophila的肝素酶II，并通过pGEX-6P载体将GST标签融合至该酶的N端。该融合策略显著提升了大肠杆菌中重组蛋白的可溶性表达。酶学性质比较分析表明，GST标签对MaHepII的反应条件（包括温度、pH和金属离子需求）无显著影响，且使酶对肝素和HS的催化效率分别提高了3.1倍和1.4倍。分子对接结果显示，GST标签的融合可能增强蛋白结构的柔性并改变底物通道的大小或形状，从而促进底物进入活性中心，提高MaHepII的催化效率。