基于构象约束策略的含吡唑微管蛋白聚合抑制剂的设计、合成与生物活性研究

本刊推荐：本研究基于构象偏好与约束策略，设计了两类新型微管蛋白聚合抑制剂（Tubulin polymerisation inhibitors）。通过分子内氢键/位阻效应（4a–4k系列）及五/七元环闭环策略（5a–5h/6a–6h系列），首次在SMART类似物设计中引入稠合环系统。活性化合物4k与5a对PC-3细胞株展现纳摩尔级抑制活性（IC50分别为15 nM与6 nM），可结合于秋水仙碱位点（CBSIs），抑制微管聚合、阻滞G2/M期、诱导凋亡并抑制迁移，具有良好类药性。

　　

引言

微管是由α/β-微管蛋白异源二聚体组装而成的长管状极性细丝，在细胞运动、胞内运输、细胞分裂和形态发生等关键细胞功能中发挥核心作用。因其重要生理功能，微管成为抗肿瘤药物的重要靶点之一。微管靶向剂可分为微管稳定剂（如紫杉醇及laulimalide位点剂）和微管去稳定剂（如秋水仙碱及长春碱位点剂）两类。秋水仙碱及其类似物如康普立停A-4（CA-4）作为秋水仙碱结合位点抑制剂（CBSIs），因其对癌细胞系的高活性、简单结构以及对P-糖蛋白（P-gp）介导的多药耐药不敏感等特点而备受关注。

4-取代甲氧基苯甲酰-芳基-噻唑（SMART）是Li等人报道的代表性CBSI，对多种癌细胞系表现出强大的抗增殖作用，且与长春新碱相比神经毒性降低。以SMART为先导化合物，研究人员设计了多种用其他芳香杂环替代SMART中B环（噻唑环）的化合物。前期研究表明，B环引起的构象偏好对SMART类似物的生物活性至关重要。其中，弯曲构象（bent-conformer）是占主导地位且具有更高活性的构象，而羰基与B环之间C-C键（化合物3中的红色键）旋转产生的伸直构象（straight-conformer）往往导致抗增殖效果下降。

构象约束策略是稳定分子活性构象的有效方法，在新SMART类似物的设计中也非常有用。引入分子内氢键（通常是B环上取代基与羰基连接基团之间）或位阻效应可以增加“弯曲”构象的比例。类似地，涉及B环的闭环方法可以直接保持分子的“弯曲”构象，从而可能增强活性。

吡唑环存在于覆盖多种药理特性的药物中，包括抗炎、抗肿瘤、抗抑郁等。因此，本研究首先设计了一系列新的SMART类似物——(4-氨基-1-芳基-1H-吡唑-3-基)(3,4,5-三甲氧基苯基)甲酮（4a–k）。用吡唑部分作为B环取代SMART中的噻唑部分，并在吡唑部分的C4位引入氨基，旨在通过氢键和位阻效应增加“弯曲”构象的比例。通过Gaussian 09软件进行的分子能量计算（DFT计算）表明，化合物4a具有相当高比例（>99.9%）的“弯曲”构象，这可能使其表现出强效活性。

闭环是药物化学中构象约束策略的另一种常用方法。在先前的工作中，应用该方法设计并合成了一些包含稠合五元/五元环或五元/六元环骨架的CBSIs。二氮杂?是一个广泛使用的模板，存在于多种镇静催眠药物中，如地西泮、阿普唑仑和奥氮平。近年来，发现一些具有二氮杂?环的化合物表现出除镇静以外的生物活性，如抗哮喘和抗癌活性。因此，引入了二氮杂?部分，设计了一个新的包含2,6-二氢吡唑并[4,3-e][1,4]二氮杂?-5(4H)-酮骨架的CBSIs系列（5a–h）。三氮杂?也存在于多种化合物中，表现出多样的药理特性，包括抗菌、免疫抑制和抗癌活性。因此，设计了更多具有新型2,6-二氢吡唑并[4,3-e][1,2,4]三氮杂?-5(4H)-硫酮骨架的CBSIs（6a–h）。这两个骨架通过闭环方法取代了4a–h的羰基连接基团和B环，以限制其活性构象。

本研究基于SMART类似物的构象约束策略，设计了两系列新型CBSIs（4a–4k和5a–5h/6a–6h），为新型微管蛋白聚合抑制剂的进一步设计提供了新的视角。

化学合成

目标化合物4a–k的合成路线如Scheme 1所示。3,4,5-三甲氧基苯甲醛（7）在氯化铜和氢氧化钾存在下，于N,N-二甲基乙酰胺中氧气氛围下与乙腈反应，得到3-氧代-3-(3,4,5-三甲氧基苯基)丙腈（8）。由相应的苯胺（9a–j）合成取代重氮盐（10a–j）。随后，化合物8与不同的重氮盐（10a–j）偶联，得到相应的腙衍生物（11a–j）。11a–j与溴乙酸甲酯环化，基于先前报道的工作，形成4-氨基-1-芳基-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰基)-1H-吡唑-5-羧酸酯（12a–j）。然后，12a–j依次水解和脱羧，得到目标化合物4a–j。化合物4k通过4j的硝基还原合成。

目标化合物5a–h的合成路线如Scheme 2所示。化合物5a-h可由4a–4h合成。Fmoc-甘氨酸（13）与二氯亚砜在CH₂Cl₂中反应得到酰氯14。4a–h的吡唑C4位氨基与14进行酰化反应，随后在CH₂Cl₂中室温下脱除Fmoc保护基，得到化合物15a–h。所需化合物5a–h由15a–h在含5%乙酸的乙醇中回流环化脱水形成。

目标化合物6a–h的合成路线如Scheme 3所示。用硫光气在CH₂Cl₂/NaHCO₃水溶液中处理4a–h，得到含异硫氰酸酯基的化合物16a–h。16a–h与过量水合肼在乙醇中回流反应，合成肼基甲硫酰胺衍生物（17a–h）。目标化合物6a–h通过17a–h在以TsOH·H₂O为催化剂的乙醇中回流进行分子内环化得到。

体外抗增殖活性

通过MTT法评估了所有目标化合物4a–k、5a–h和6a–h对人胃癌细胞系SGC-7901和人乳腺癌细胞系MCF-7的体外抗增殖活性。以秋水仙碱作为阳性对照。

两系列中的大多数化合物表现出中等至高的抗增殖活性。在4a–k中，化合物4a、4g和4k显示出较高的活性，这表明在C环的对位无取代或取代极性基团可以增加活性。4f和4j的强效活性也支持了这一观点。化合物4k显示出最高的活性，对SGC-7901细胞系的IC₅₀值为0.017 ± 0.002 μM，对MCF-7细胞系的IC₅₀值为0.031 ± 0.005 μM。

化合物5a–h也对癌细胞系表现出中等至高的活性。5a、5c、5d和5f比其他同系列化合物活性更高，表明在C环的邻位/对位无取代或取代小基团可以增加该系列化合物的活性。同时，间位取代或大取代基（5b、5e和5g）可能会降低活性。化合物5a在5a–h系列中活性最高，对SGC-7901细胞的IC₅₀值为0.018 ± 0.003 μM。

在6a–h中，具有对位甲基（6c）或邻位氟（6d）取代的化合物显示出高活性（对SGC-7901细胞系的IC₅₀值分别为0.151和0.087 μM，对MCF-7细胞系分别为0.123和0.398 μM），而间位或对位氟取代（6e和6f）导致活性下降。

总体而言，4a–k系列对SGC-7901细胞系的效力与5a–h系列相似，但对MCF-7细胞系的效力更好。6a–h系列在两个系列中显示出最低的活性。化合物4k对SGC-7901和MCF-7细胞系表现出最高的活性。

额外测试了活性化合物4k和5a对人结肠癌细胞系HCT-116、人非小细胞肺癌细胞系A549和人前列腺癌细胞系PC-3的抗增殖活性。化合物4k对另外三种细胞系表现出高活性，对HCT-116细胞系的IC₅₀值为0.010 μM。同时，化合物5a对A549和PC-3细胞系表现出高活性（IC₅₀值分别为0.063和0.006 μM），但对HCT-116细胞系（0.163 μM）效力较低。尽管对不同细胞系的活性存在差异，但化合物5a对PC-3细胞表现出最高活性，IC₅₀值为0.006 μM。

还测试了化合物4k和5a对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和人肝细胞（L02）的毒性。结果表明，4k、5a和秋水仙碱的SI-H（HUVEC选择性指数，在正常细胞HUVEC中的IC₅₀/在癌细胞PC-3中的IC₅₀）分别为39.11、147.7和13.95，表明4k和5a的毒性低于秋水仙碱。此外，5a的SI-L（L02选择性指数）为35.00，可能表明5a的毒性低于4k和秋水仙碱。

计算研究

分子对接研究

选择最有效的化合物4k和5a通过分子相互作用来解释其效力。化合物与DAMA-秋水仙碱-微管蛋白复合物（PDB: 1SA0）的对接结果如图3所示。4k和5a都可以以与DAMA-秋水仙碱相似的姿势结合在α和β-微管蛋白上的秋水仙碱结合位点。4k和5a的A环和C环占据了结合位点的两个疏水沟。还观察到化合物4k/5a与几个重要残基（如β-Cys241、β-Ala250、β-Val315、β-Lys352、α-Val181）之间的疏水相互作用。此外，结合位点有足够的空间容纳4k B环上的氨基和5a的二氮杂?环。值得注意的是，观察到4k C环上的氨基与β-Val315之间形成了一个氢键。这些相互作用可能增强了4k/5a与微管蛋白之间的相互作用，从而提高了化合物的抗增殖活性。

分子动力学模拟研究

为了进一步研究结合模式，对微管蛋白（PDB: 1SA0）与化合物4k、5a和天然配体DAMA-秋水仙碱的对接姿势进行了三次100 ns的分子动力学模拟。收集了均方根偏差（RMSD）和均方根波动（RMSF）数据进行分析。如图4所示，4k和5a的RMSD值在100 ns模拟后分别围绕1.5 ?和2.0 ?波动，证明了两种结合模型良好的稳定性。与配体4k、5a和DAMA-秋水仙碱结合的微管蛋白原子的RMSF值表现出相似的波动和配体接触（由绿线表示），表明三种配体（4k、5a和DAMA-秋水仙碱）与微管蛋白之间的结合模式相似。

理化性质预测

通过SwissADME网站预测了化合物4k、5a和先导化合物SMART的理化性质，以评估它们的类药性。测得化合物4k、5a的值均在类药性质范围内，表明化合物4k、5a表现出良好的类药性，且没有违反Lipinski五规则。此外，预测的4k（-4.73）和5a（-4.11）的LogS值高于SMART（-5.71），表明与SMART相比，4k和5a具有更好的水溶性。

计算机毒性研究

通过ADMETlab 3.0网站预测了化合物4k和5a的毒性数据。化合物4k在几个毒性相关属性（包括hERG-10、SkinSen、EI和H-HT）方面表现出比SMART更低的毒性，而5a在hERG-10、DILI、Ames、EI和Resp方面表现出更低的毒性。结果表明，与SMART相比，化合物4k和5a在某些方面的毒性有所降低。

微管蛋白聚合抑制

为了研究化合物4k和5a对微管系统的影响，使用体外微管蛋白聚合试验评估了它们的微管蛋白聚合抑制活性。秋水仙碱用作微管蛋白聚合抑制的阳性对照，而紫杉醇用作阴性对照。如图5所示，当微管蛋白用4k（5 μM和10 μM）、5a（10 μM和20 μM）或秋水仙碱（3 μM）处理时，荧光强度的增长趋势减慢，表明微管蛋白聚合受到抑制。5 μM和10 μM的化合物4k表现出比3 μM秋水仙碱更高的效力，而20 μM的5a也表现出优于秋水仙碱（3 μM）的抑制效力。此外，化合物4k和5a显示出剂量依赖性的微管蛋白聚合抑制，较高浓度显示出更强的抑制活性。相反，紫杉醇增强了微管聚合。这些结果表明，4k和5a是有效的微管蛋白聚合抑制剂，可能靶向秋水仙碱结合位点。

免疫荧光研究

为了评估4k和5a对细胞内微管的影响，进行了免疫荧光测定以观察细胞中微管网络的变化。选择PC-3细胞进行此测试，并使用秋水仙碱作为阳性对照。如图6所示，与对照组相比，用秋水仙碱（20 nM）、4k（50 nM）或5a（50 nM）处理的大多数细胞显示出形状变化，并且微管网络被破坏。结果表明，化合物4k和5a与秋水仙碱类似，在癌细胞中抑制微管蛋白聚合。

细胞周期研究

细胞周期的G₂/M期涉及微管的大量生理活动，微管蛋白聚合抑制剂可通过抑制微管聚合使细胞周期阻滞在G₂/M期。为了研究4k和5a对细胞周期的影响，使用流式细胞术分析了用秋水仙碱（10 nM, 20 nM）、4k（10 nM, 25 nM, 40 nM）、5a（50 nM, 70 nM, 100 nM）或载体处理的PC-3细胞的细胞周期。如图7所示，用不同浓度的4k和5a处理后，处于G₂/M期的细胞比例从15%分别增加到33–71%（4k在10–40 nM）和35%或71%（5a在70或100 nM）。结果表明，化合物4k和5a与秋水仙碱类似，可以将PC-3细胞阻滞在G₂/M期。

此外，采用蛋白质印迹法检测了细胞周期相关蛋白细胞周期蛋白依赖性激酶1（CDK1）和细胞周期蛋白B1（Cyclin B1）的表达水平。如图8所示，化合物4k和5a在浓度分别为40和20 nM时可增加CDK1的水平，在浓度分别为20和40 nM时可增加Cyclin B1的水平，这些浓度大约是IC₅₀值的一到三倍。这些结果表明，4k和5a破坏了微管动力学，导致G₂/M期阻滞和细胞周期相关蛋白的失调。

细胞凋亡分析

微管蛋白聚合抑制被证明可进一步诱导癌细胞凋亡。在PC-3细胞系上进行MTT测定，以测试用不同浓度的化合物4k和5a处理24小时（与免疫荧光测定相同的时间）后的细胞活力。结果显示，用4k（浓度从0.51 nM到1111 nM）和5a（浓度从0.51 nM到1111 nM）处理后，细胞活力下降，分别从91.6%降至41.6%和从76.6%降至39.6%，这表明微管蛋白聚合抑制引起了细胞凋亡。

为了研究4k和5a对细胞凋亡的影响，使用流式细胞术分析了PC-3细胞的凋亡情况。用秋水仙碱（10 nM, 20 nM）、4k（5 nM, 10 nM, 25 nM）、5a（50 nM, 100 nM, 200 nM）或载体处理的细胞使用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒进行染色。早期凋亡细胞只能被Annexin V-FITC染色，而晚期凋亡细胞可被Annexin V-FITC和PI共同染色。如图9所示，化合物4k可将凋亡细胞百分比从18.3%增加到27.1%（10 nM）和34.1%（25 nM），化合物5a也可将凋亡细胞百分比从18.2%增加到26.6%（100 nM）和41.5%（200 nM）。

还通过蛋白质印迹法测量了4k和5a处理后细胞凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2和cleaved caspase-9）的表达。如图10所示，化合物4k和5a可以剂量依赖性地增加Bax、cleaved caspase-9的水平并降低Bcl-2的水平。用20, 40 nM的4k或10, 20, 40 nM的5a处理后，PC-3细胞中Bax的表达显著增加，而用10, 20, 40 nM的4k或5, 20, 40 nM的5a处理后，Bcl-2的表达显著降低。结果表明，化合物4k和5a可通过调节凋亡相关蛋白显著诱导细胞凋亡。

细胞迁移 assays

为了研究4k和5a对细胞迁移的影响，在PC-3细胞上进行了伤口愈合试验。如图11所示，当PC-3细胞用10 nM, 20 nM的4k或10 nM, 20 nM的5a处理时，其迁移活性降低，恢复百分比分别为42.7%（10 nM 4k）、20.2%（20 nM 4k）、32.3%（10 nM 5a）和23.3%（20 nM 5a），而对照组为48.7%。

为了进一步研究4k和5a对细胞迁移的影响，在PC-3细胞上使用了Transwell迁移试验。如图12所示，用4k（5, 10, 和20 nM）或5a（5, 10, 和20 nM）处理24小时后，迁移细胞的百分比显著下降，分别表现为60.4%、25.7%、18.7%（4k）或53.6%、49.1%、27.8%（5a），且呈剂量依赖性。这些结果表明了4k和5a对PC-3细胞迁移的抑制作用。

克隆形成 assay

选择克隆形成试验来评估4k和5a对PC-3细胞克隆形成的影响。如图13所示，化合物4k和5a可以剂量依赖性地抑制克隆形成。值得注意的是，用20 nM的4k处理后，PC-3细胞的克隆形成几乎被完全抑制（与对照相比为5.7%）。用20 nM的5a处理的PC-3细胞的克隆形成也抑制到对照组的34.9%。结果表明，化合物4k和5a可以抑制PC-3细胞的克隆形成，证明了4k和5a在破坏PC-3细胞克隆形成方面的有效活性。

结论

本研究基于SMART类似物的构象约束策略，设计了两类新的微管蛋白聚合抑制剂（4a–4k和5a–5h/6a–6h）。通过氢键和位阻效应设计了化合物4a–4k，通过稠合五元和七元环的闭环方法设计了化合物5a–5h/6a–6h，该方法首次用于新型SMART类似物的设计。所有目标化合物均采用适当方法合成。采用MTT法评估了所有目标化合物对SGC-7901和MCF-7细胞系的体外抗增殖活性。额外使用了HCT-116、A549、PC-3和HUVEC细胞系测试活性化合物4k和5a的抗增殖活性。在这些化合物中，4k和5a显示出最高的抗增殖活性，对PC-3细胞系的IC₅₀值分别为0.015 ± 0.004和0.006 ± 0.002 μM，并且对人正常细胞HUVEC的毒性较低。分子对接研究表明，4k和5a都可以以“弯曲”构象结合到秋水仙碱结合位点，且姿势与DAMA-秋水仙碱相似。进一步的分子动力学模拟显示了微管蛋白与三种配体（4k、5a和DAMA-秋水仙碱）之间结合模式的相似性。理化性质预测显示4k和5a具有良好的类药性，没有违反Lipinski五规则，并且水溶性优于SMART。计算机毒性研究表明，与SMART相比，化合物4k和5a在某些方面的毒性有所降低。最后，一系列机制研究表明，化合物4k和5a抑制微管蛋白聚合，将PC-3细胞阻滞在G₂/M期，诱导细胞凋亡，抑制细胞迁移并阻止PC-3细胞的克隆形成。额外的蛋白质印迹分析表明，化合物4k和5a可以上调CDK1、cyclin-B1、Bax、cleaved caspase-9的表达，并下调Bcl-2的表达。这些结果证明化合物4k和5a都是有效的微管蛋白聚合抑制剂。这项工作也展示了使用稠合五元和七元环进行闭环方法的应用，为CBSIs的进一步研究奠定了基础。