商业杀菌剂与植物共生甲基杆菌的相容性研究：揭示其在农业综合病虫害管理中的潜力

本综述系统评估了40株甲基杆菌（Methylobacterium）对四种主流商业杀菌剂制剂（含azoxystrobin、fludioxonil、metalaxyl-M）的敏感性。研究通过扩散盘法证实，所有测试菌株在推荐剂量（1–100 μg）乃至更高浓度下均未表现敏感性，且对敏感病原菌Fusarium graminearum有效。该发现为植物促生菌（PGPB）与化学杀菌剂的协同应用提供了关键依据，对推动农业综合病虫害管理（IPM）策略具有重要实践意义。

　　

Abstract

共生性甲基杆菌（Methylobacterium）构成植物微生物组的重要部分，已知能促进宿主植物生长、发育、非生物胁迫耐受性和增强疾病抗性。当代农业实践中商业广谱杀菌剂制剂的广泛应用使得研究流行农药产品与细菌内生菌的相容性成为必要，尤其是随着甲基杆菌日益被考虑用于农艺用途，包括植物病原体的生物防治。本研究评估了40株甲基杆菌菌株对商业农药制剂的相容性，每种制剂含有不同的活性成分：DYNASTY?和QUADRIS?（azoxystrobin）、MAXIM?480（fludioxonil）和APRON XL? LS（metalaxyl-M）。使用扩散盘法，在推荐治疗窗口内及以上的剂量（1–100 μg）下，未检测到测试甲基杆菌菌株对任何杀菌剂产品的敏感性。使用敏感植物病原体Fusarium graminearum确认了相同范围内制剂的有效性。随着甲基杆菌 spp. 继续成为生物技术（包括农业）中各种角色的合适候选者，更好地了解这一重要属与商业杀菌剂产品之间的相容性已成为综合病虫害管理实践的相关考虑。

Introduction

复杂且普遍存在的真菌植物病原体，包括Rhizoctonia spp. 和Fusarium spp.，由于其全球分布和广泛的宿主范围而带来深远影响。例如，Rhizoctonia solani 主要被认为是水稻（Oryzae sativa）纹枯病的致病因子，马铃薯（Solanum tuberosum）的黑痣病和茎腐病，以及大豆（Glycine max）的下胚轴腐烂病，但这种土传坏死营养体也对超过200种其他植物物种具有致病性。类似地，Fusarium graminearum 物种复合体的成员在全球范围内作为社会经济重要谷物（小麦、大麦、燕麦和玉米）中赤霉病的主要致病因子占主导地位。

因此，合成杀菌剂通常被预防性地用作种子包衣、叶面喷雾或果实采后处理，并且现在存在新的制剂来治疗田间的活跃爆发。特别重要的是甲氧基丙烯酸酯（第11组）、酰基丙氨酸（第4组）和苯基吡咯（第12组）杀菌剂家族——其中最成熟的成员分别包括azoxystrobin、metalaxyl-M和fludioxonil。

这些化合物的发现代表了农业化学的突破，因为metalaxyl-M和azoxystrobin的系统性和广谱活性特别提供了三个层次的作用同时进行：(a) 防止病原体侵入，(b) 治愈现有感染，和 (c) 根除田间的植物病原体负荷。使用不同的作用机制，这三种药剂经常成对部署，有时全部一起使用（MAXIM? QUATTRO, Syngenta, Canada）。

调查杀菌剂制剂对植物相关细菌影响的研究主要集中于根际内的种群动态，并且迄今为止通常倾向于报告两种可能的结果：(a) 根际细菌的种群密度或多样性丰富度没有可察觉的变化，或 (b) 细菌种群密度初始下降随后恢复。有趣的是，土壤微生物对metalaxyl-M的降解已在文献中得到充分证实，一些研究表明土壤细菌在反复暴露后可能变得敏感。这在植物病原体控制中提出了挑战，因为土壤微生物对杀菌剂的降解可能使浓度降至亚治疗水平。

有趣的是，甚至有报道称，与对照组相比，对metalaxyl-M的响应中，种群密度和总内生菌物种丰富度均有所增加。虽然metalaxyl的作用机制被认为部分是由于中断易感真菌中的RNA生物合成，但最近的研究表明，该化合物可能通过刺激有益的土壤内生菌来控制病原体生物负荷。然而，关于杀菌剂和市售制剂对叶际栖息的细菌内生菌影响的研究在很大程度上仍未探索。

甲基杆菌（Methylobacteriaceae科，Alphaproteobacteria纲）通常是植物相关的细菌，具有全球分布，已从各种自然来源中分离出来，包括土壤、空气、市政水、人类和发酵食品。几个物种也从一系列看似敌对的环境中收集，包括航天器和污染的工业场所。甲基杆菌是需氧的、革兰氏阴性菌，其独特的粉红色色素是该属的可识别属性，但有一些例外（Methylobacterium jeotgali）。

尽管考虑用于生物技术，但关于甲基杆菌农艺潜力的工作体系正在迅速扩大。被归类为植物促生细菌（PGPB），某些甲基杆菌菌株产生独特高水平的植物激素，包括细胞分裂素（CK），这些激素能增强光合能力并改善结实。甲基杆菌与植物微生物组的长期关联，则被认为最可能是由甲醇排放维持的，这些排放源于对微生物来源的生长促进植物激素的响应而 stimulated 的细胞壁重塑 heightened。甲基杆菌 spp. 也可能保护宿主植物免受生物胁迫，包括植物病原体，正如它们在地花生中促进过氧化物酶活性以及在番茄中诱导微生物群种群变化和植物抗毒素生物合成所确立的那样。

响应于甲基杆菌在作物健康中作用的证据，几种商业生物接种剂产品已经进入国际市场。然而，生物作物保护剂与当代农业技术和农用化学品的相容性仍然是一个至关重要的考虑因素。叶际微生物组的完整性与宿主生产力相关，通过改善经济重要作物的光合能力、开花和果实充实。因此，生物接种剂与杀菌剂处理的整合为植物病原体管理提供了一条最佳路径：通过协同效应增强病原体控制，延长控制持续时间，并减少杀菌剂抗性。

本研究的目标是检查广泛范围的甲基杆菌分离株（来源和表型独特）对含有三种流行广谱杀菌剂：azoxystrobin、fludioxonil和metalaxyl-M的市售产品的敏感性。据作者所知，这项研究是首次对甲基杆菌 spp. 与商业杀菌剂产品之间相容性的全面评估。

Materials and methods

Chemicals and materials

本研究中使用了商业杀菌剂制剂：DYNASTY? 100FS (Syngenta Canada, azoxystrobin 10% w/v, PCP Reg. No. 28394), QUADRIS? (Syngenta Canada, azoxystrobin 23% w/v, PCP Reg. No. 26153), MAXIM? 480FS (Syngenta Canada, fludioxonil 40% w/v, PCP Reg. No. 27001), 和 APRON XL? LS (Syngenta Canada, metalaxyl-M 33% w/v, PCP Reg. No. 25585)。由于商业配方的专有性质，无法确定确切成分，包括使用的表面活性剂的类型和数量等佐剂。每种杀菌化合物的纯形式购自Millipore Sigma。氨苄青霉素钠盐（BioShop?; Burlington, Canada）用作阳性对照。超纯水（18.2 MΩ cm）来自Milli-Q系统。获得无菌的空白纸片（Oxoid, Fisher Scientific），直径6 mm（～1 mm厚度），用于进行改良的纸片扩散（Kirby Bauer）敏感性测定。

Selection of bacterial strains and culture conditions

细菌培养物的制备在生物安全柜（BSC）中无菌进行。冻干的甲基杆菌 spp. 储备培养物从四个微生物保藏中心获得：比利时协调微生物保藏中心（BCCM/LMG）、德国微生物和细胞培养物保藏中心（DSMZ）、日本微生物保藏中心（JCM）以及国家技术与评估研究所生物资源中心（NBRC）。菌株最初从不同的生物（活植物）和自然非生物来源（土壤、水、空气）收集。关于菌株分类学、起源和已知特性的信息在表1中提供。冻干菌株在营养丰富的Reasoner's 2A（R2A）肉汤（VWR, Mississauga, Canada）中复活，并作为15%（v/v）甘油储备在-80°C低温保存。

Revival of cryogenic stocks

使用无菌接种环将甲基杆菌菌株无菌划线在营养丰富的R2A上。在27°C孵育5天后，从每个平板上提取单菌落，用于接种250 mL玻璃锥形瓶中的50 mL R2A液体生长培养基，并在旋转培养箱中维持5天（27°C和120 RPM）。当甲基杆菌培养物在大约6天后达到指数生长后期/稳定期早期时（OD₆₀₀ = 0.6–1.2，取决于菌株，大约10⁸ CFU/mL）（Genesys? 10s可见分光光度计, Thermo Fisher Scientific），从TSB液体培养基中使用无菌接种环和划线法接种营养最低琼脂平板。选择性最低营养培养基根据DSMZ（“德国微生物和细胞培养物保藏中心”）的甲基杆菌生长培养基配方（DSMZ Index 125）制备：KNO₃—1.00 g; MgSO₄ × 7H₂O—0.2 g; CaCl₂ × 2H₂O—0.02 g; Na₂HPO₄—0.23 g; NaH₂PO₄—0.07 g; FeSO₄ × 7H₂O—1.00 mg; CuSO₄ × 5H₂O—5 μg; H₃BO₃—10 μg; MnSO₄ × 5H₂O—10 μg; ZnSO₄ × 7H₂O—70 μg; MoO₃—10 μg; H₂O—1000 mL; CH₃OH—5 mL; pH 6.80。转移到最低营养培养基是为了确保对甲基杆菌的高选择性并减少冷藏储备平板污染的可能性。在27°C孵育5天后，从每个平板上提取每种细菌的单菌落，并根据需要用于接种培养瓶。DSMZ营养最低平板作为储备平板，用parafilm密封，并在4°C下最多保存20天。

Preparation of disk diffusion assay

Kirby Bauer敏感性测定是一种使用浸渍纸片和琼脂平板视觉评估微生物菌株对特定化合物敏感性的方法。在本研究中，将加载了每种杀菌剂制剂的无菌6 mm纸片（Oxoid, Fisher Scientific）在立即接种甲基杆菌菌株后放置在R2A琼脂平板上。纸片加载体积的优化先前进行，基于120分钟后的干燥度确定为20 μL。

杀菌剂制剂无菌处理，使用前未经过滤灭菌。使用无菌等渗溶液（0.9% NaCl [w/v]）作为稀释剂，以达到相对于每种制剂中活性成分（AI）的所需浓度。敏感性测定中包含的最终浓度选择旨在跨越Syngenta Canada Inc.为每种制剂提供的产品专论中指示的用于大豆（Glycine max）种子处理的推荐施用率。基于100 kg（～6600粒种子），Syngenta推荐：DYNASTY? 每粒种子1.5–3.0 μg AI（azoxystrobin），APRON XL? 每粒种子23 μg AI（metalaxyl-M），和MAXIM? 每粒种子6 μg AI（fludioxonil）。QUADRIS?（azoxystrobin）叶面喷雾专论推荐第6组作物（包括大豆）的施用率为500 mL/ha。假设每英亩成功立苗135,000株植物（～335,000/ha OMAFRA）并且最小推荐稀释度为500 mL每45 L淡水，预计到达每株植物的azoxystrobin最大浓度将为～8–10 μg（罐混液的0.14 mL/植物）。

因此，杀菌剂制剂的浓度，相对于每种产品中AI的浓度，统一测试在最终总剂量为1, 10, 50,和100 μg的每种AI，使用纸片敏感性测定。氨苄青霉素HCl的阳性对照制备在与杀菌剂产品相同的浓度。使用无菌等渗溶液加载阴性对照纸片。纸片的制备，包括杀菌剂产品的连续稀释，以及所有处理组中每个纸片的加载，均无菌进行。加载溶液通过连续稀释制备，并使用过滤移液器将20 μL每种溶液转移到包含在空无菌玻璃培养皿中的纸片上。每个培养皿被覆盖并允许干燥2小时。

Fungicide formulation sensitivity assay

由于使用营养最低的DSMZ 125大大增加了获得甲基杆菌融合层所需的时间，营养丰富的R2A培养基用于纸片扩散敏感性测定。培养皿（Fisher Brand, 100 × 15 mm）含有20 mL R2A（1.5%琼脂[w/v]）的均匀体积，使用永久性标记在底座外表面划分为四个象限。将100 μL的7天龄（～10⁸ CFU/mL）未稀释液体培养物（R2A）沉积到每个单独测试平板的表面上。使用L形涂布棒将接种物均匀铺展在琼脂表面，然后覆盖并在BSC中在黑暗条件下约22°C干燥30分钟。

使用无菌镊子，将含有杀菌剂制剂的干燥纸片（前一天制备）转移到测试平板上，在相应象限的中心。阴性对照纸片放置在每个培养皿的中心，在象限线的交点处。阳性对照（氨苄青霉素）放置在一个单独的象限中。平板用parafilm密封，并在27°C黑暗条件下倒置储存。在接种后3、5和7天评估并拍摄每个纸片周围的抑菌圈（Geliance 600成像系统, Perkin Elmer）。使用GeneSnap（ver. 7.04.06, Synoptics Ltd.）进行基本照片处理，包括调整亮度和对比度以清晰可见微生物生长。抑菌圈通过测量无微生物生长区域的整个横截面（包括纸片直径）来确定。每种细菌菌株对每种杀菌剂制剂的暴露实验在每个浓度水平下进行三次重复。该实验还使用大肠杆菌（Escherichia coli）（?-内酰胺敏感, NM522）进行重复，以验证氨苄青霉素对照纸片的性能。

方法对照平板使用与测定平板相同的技术制备，但不接种甲基杆菌。方法对照平板用于验证无菌技术并确认商业产品不含活体生物。

Verification of diffusion

为了验证改良纸片扩散测定的功能性，使用从阿尔伯塔大学微真菌收藏和植物标本馆（UAMH）（Gage Research Institute, University of Toronto, Canada）（UAMH 3329）获得的F. graminearum分离物进行了第二次实验迭代。验证是用已知易感生物进行的，以确保纸片的材料与商业产品的复杂配方相结合，不会抑制杀菌AI扩散到生长区域的能力。简而言之，从冷藏的14天龄F. graminearum储备平板边缘收集一个2 mm琼脂塞，并无菌转移到新鲜PDA平板的中心。含有商业杀菌剂制剂的纸片放置在三个相应的象限中，阴性对照（水）在剩余的象限中。测试平板用parafilm密封，并在27°C倒置孵育5天。在测试剂量范围（1–100 μg AI）内以三次重复进行有效性确认。如果易感生物在5天后未在含有杀菌剂纸片的象限中生长，则认为扩散成功。

Results

Insensitiveness of Methylobacterium to commercial fungicides

在所有检查的40株甲基杆菌菌株中，未检测到对任何测试的杀菌剂制剂有任何可测量的抑菌圈，即使在最高浓度100 μg下也是如此。有趣的是，在几种情况下，观察到许多甲基杆菌菌株定殖在用含有metalaxyl-M（APRON XL? LS）的制剂处理的纸片上。然而，这种行为未在含有azoxystrobin或fludioxonil的产品中观察到。由于甲基杆菌分离株在肉汤中形成聚集体的 well-documented 倾向，许多甲基杆菌分离株的融合生长可以形成不均匀的线和脊。

然而，在几乎所有情况下，都观察到对氨苄青霉素阳性对照的敏感性，尽管在100 μg剂量下，所有40株测试菌株的可测量抑菌圈均<20 mm，表明该属仅对?-内酰胺抗生素中度敏感。值得注意的是，尽管甲基杆菌extorquens（JCM 2805）、甲基杆菌organophilum（NBRC 103119）和甲基杆菌radiotolerans（LMG 2269）之间的氨苄青霉素敏感性存在变异性，所有三种分离株即使在最大剂量（100 μg）下也显示出对杀菌剂制剂的完全不敏感性，这对于所有其他测试的分离株都观察到。重要的是，大肠杆菌检查平板对氨苄青霉素显示出高敏感性（>20 mm），如预期的那样，通过测试范围（1–100 μg），进一步验证了阳性对照的扩散有效性。

在甲基杆菌的敏感性方面，无法确定设计用于种子包衣和叶面喷雾的制剂之间存在可辨别的差异。加载无菌等渗溶液的对照纸片在任何菌株中均未显示敏感性迹象。重要的是，方法对照平板在27°C黑暗条件下孵育10天后未显示微生物生长，确认商业产品不含微生物污染。由于每种AI的纯形式在去离子水中的固有低溶解度：azoxystrobin约6.7 mg/L，fludioxonil约1.8 mg/L，metalaxyl-M约7.1 mg/L，无法使用每种AI的纯形式重复纸片敏感性测定。鉴于对每种含有AI以及无数佐剂和表面活性剂的商业制剂没有 discernable 敏感性，尝试通过添加添加剂来改善纯水-杀菌剂悬浮液的溶解度和渗透性是没有必要的。

涉及F. graminearum的实验证实了改良纸片扩散方法的有效性，使用了与涉及甲基杆菌 spp. 的敏感性测定相同的方法学。在测试浓度范围内，PDA上的真菌增殖立即明显减少（相对于对照菌丝生长面积减少88%），此外还有明显的向阴性对照纸片的偏好性生长。

Discussion

研究商业农用化学品与可持续生物产品的相容性对于促进有效的农业实践、保护人类健康、管理农药抗性和确保农业的长期可持续性至关重要。我们的工作首次全面检查了四种广泛应用的杀菌剂制剂与叶际相关甲基杆菌分离株的相容性。结果表明，通过体外敏感性测定，甲基杆菌与测试的杀菌剂制剂完全相容。所有测试菌株的增殖和形态均未被浸渍有商业杀菌剂的纸片的存在所干扰，并且在任何实验重复中均未 discernable 可测量的抑菌圈，无论测试的AI浓度如何。用易感植物病原体F. graminearum确认效力证实了纸片扩散方法的有效性，因为菌丝生长在含有浸渍杀菌剂制剂的纸片的象限中被强烈抑制。

虽然关于杀菌剂对植物微生物组影响的研究主要集中于根际，但关于叶际细菌的可用研究反复报告Proteobacteria（α-、β-和γ-）是大多数植物中的主要细菌定殖者。叶际细菌对杀菌剂的敏感性结果因AI、产品配方和宿主植物的性质而有很大差异。然而，Proteobacteria——甲基杆菌属于此类—— consistently 显示出对杀菌剂处理的 resilience，无论是在原位还是体外。例如，用含有enostroburin、kresoxim-methyl和iprodione的制剂进行叶面处理分别导致小麦、烟草和胡椒中Alphaproteobacteria丰度增加。在将葡萄（Vitis vinifera）中分离的表皮和内生细菌暴露于七种不同商业杀菌剂产品的平板测定中，97%的Firmicutes（40/41）—— formerly “Bacillota”——对四种或更多制剂表现出敏感性，而只有12%的Proteobacteria（严格β-和γ-）分离株（5/42）受到类似影响。在治疗破坏性叶部疾病烟草靶斑病（由Rhizoctonia solani引起）时，施用AMISTAR? TOP（EPA Reg. 100–1313）——一种含有azoxystrobin（第11组）和difenoconazole（第3组）的商业浓缩物—— induced 叶际细菌群落整体多样性的增加，并且重要的是，在18天的处理期内，对附生甲基杆菌的相对丰度影响很小。然而，这种门水平的 resilience 并非 universal。例如，用dimethachlon（N-(3,5-二氯苯基)琥珀酰亚胺）进行叶面处理以控制烟草褐斑病（Alternaria alternata）导致Alphaproteobacteria丰度显著下降，而甲基杆菌在天然宿主（Nicotiana tabacum）中占主导地位。

关于苯基酰胺（metalaxyl-M）和苯基吡咯（fludioxonil）杀菌剂类别对叶际影响的研究同样很少，尽管它们应用广泛。特别是像fludioxonil这样的多氟化杀菌剂，以其在自然土壤环境中降解缓慢为特征，半衰期通常超过100天， due to 低微生物驱动的代谢。在最近的一项研究中，一种从先前用fludioxonil富集的土壤中分离的甲基营养Methylobacillus sp.（β-proteobacteria）菌株在受控条件下无法有意义地 catabolize 该杀菌剂，但在其他方面不受其存在的影响。

关于metalaxyl-M，检查土壤菌群的研究通常报告种群密度减少，尽管持续施用杀菌剂，但最终会恢复。 prevailing 理论认为，初始细菌种群下降代表了 metalayl-M 不耐受菌株的 elimination，为耐受菌株反弹重新分配了资源可用性。关于metalaxyl-M对叶际影响的研究甚至更为有限。一项关于胡椒（Capsicum annum L. cv Ozho）微生物组对metalaxyl-M（REDOMIL GOLD? SL, EPA Reg. 100-1202）叶面施用响应的可用研究揭示了Enterobacteriaceae（γ-proteobacteria）对处理的 positive 响应。然而，我们的工作首次报告了这些相同成分对叶际细菌响应的属水平信息，并提供了它们与甲基杆菌相容性的直接证据。

将PGPB如甲基杆菌纳入当代综合病虫害管理（IPM）实践 presents 新的机会来改善养分利用和胁迫耐受性。有趣的是，几种含有一株或多株甲基杆菌的产品已经上市：M-BOS? (NutriAg LTD; Ontario, Canada), Utrisha? and BlueN? (acquired by Corteva Biologicals; Alberta, Canada originally from Symborg Inc.; California, USA), METILO? (Tangsons Biotech; Changsha, China), and Green Plus? (Farmer's Bio Fertilizers; Tamil Nadu, India)。

具有广泛的作物相容性和应用多功能性（种子处理、沟灌和叶面喷雾），含有PGPB的产品被推销为一种安全且可再生的强化作物的方式。因此，相容性研究对于确定这些生物产品是否可以与合成化学品一起有效使用至关重要。特别是产品的 tank-mixing 和 co-application 可以导致显著的成本节约，因为与燃料消耗、水资源利用、劳动力、土壤压实和作物机械损伤相关的总体费用可以减少。这些因素对于营养生长快且对真菌植物病原体高度敏感（草莓）的作物是重要的考虑因素，这些作物需要更 aggressive 的农药方案。然而，tank-mix 限制对于 microbiome-enhancing 产品几乎是 universal 的，因为产品标签通常建议不要与大多数商业农用化学品共同施用。通过我们对甲基杆菌的工作，我们报告了所有分离株与每种测试商业产品在亚临床（1 μg）和过量（100 μg）AI浓度下相容的证据。我们的结果表明，在某些情况下，使用杀菌剂对叶际中PGPB的 viability 是安全的。

值得注意的是，这里研究的杀菌剂在美国注册产品数量方面排名前5位AI（分别为第一、第二和第四）。例如，在美国环境保护署（US EPA）的植物产品数据库（Crop Data Management Systems Inc.）和农药产品及标签系统的搜索中，azoxystrobin作为唯一系统性杀菌剂出现在82种许可用于大麦的产品中的34种（41%），107种用于玉米的产品中的42种（39%），99种用于马铃薯的产品中的27种（27%），138种用于大豆的产品中的48种（35%），以及110种注册用于草莓的产品中的30种（27%）。对于特种作物，变异性甚至更具限制性：在19种许可用于香草（Vanilla spp.）和藏红花（Crocus sativus）的产品中，18种含有azoxystrobin作为唯一AI。

与生物产品的相容性促进了缓冲对合成杀菌剂依赖的作物保护实践。被称为 chemically induced endophyte-mediated disease suppression，研究人员发现了一些实例，其中杀菌剂（包括metalaxyl-M）的应用通过刺激植物相关微生物来增强疾病保护——甚至对抗先前 metalaxyl-resistant 的植物病原体。降低投入成本、改善土壤健康和增强疾病抵抗力是强大IPM架构的核心支柱——其中，有益内生菌的使用现已成为一部分。

本研究的结果支持了关于Proteobacteria对杀菌剂普遍不敏感和耐受性的现有文献，在甲基杆菌属水平上提供了该趋势的进一步确证，并报告了测试的商业药剂与含有PGP甲基杆菌的 microbiome-enhancing 产品 co-application 可行性的直接证据。

Conclusion

我们关于甲基杆菌与流行商业杀菌剂产品相容性的工作表明，该属的成员耐受与其全配方中的杀菌剂接触，其浓度不仅模拟而且超过了制造商指定的推荐AI浓度。我们工作的结果表明，适当遵守产品专论中关于产品稀释的说明将允许将甲基杆菌作为生物防治剂与当代化学剂进行 tank mixes，而不会对生物接种剂造成伤害。对PGPB（包括甲基杆菌 spp.）研究的坚持可能会产生可行的农业改良剂，从而 bolstering 年产量。

Acknowledgements

作者谨向Trent大学的Barry Saville博士和Emma Kaszecki女士，以及热带研究与教育中心（University of Florida, IFAS-TREC）的Romina Gazis博士表示诚挚的感谢。