芦笋AP2/ERF转录因子（DREB与ERFs）响应冷胁迫的鉴定与表达分析及其在抗寒机制中的功能研究

本研究首次在芦笋中系统鉴定并功能分析了AP2/ERF转录因子家族成员，揭示DREB2C与DREB2B基因在冷激（cold shock）和冷驯化（cold acclimation）过程中的显著上调表达模式，以及ERF062、ERF109和ERF113的负向调控作用。研究通过qRT-PCR验证基因表达时空特异性，为解析芦笋抗寒分子机制及作物抗逆育种提供关键靶点。

　　

引言

低温是限制植物生长、发育和生产力的主要环境胁迫因素。植物通过复杂的分子调控机制应对低温，其中冷驯化（cold acclimation）作为适应性过程，通过非冰冻温度预处理提升植物的冷冻耐受性。这一过程涉及碳水化合物积累、脂质组成改变以及细胞膜结构修饰等生理生化变化。APETALA2/乙烯响应因子（AP2/ERF）转录因子在植物冷驯化调控中发挥关键作用，该家族主要包括脱水响应元件结合蛋白（DREB）和乙烯响应因子（ERF）两个亚家族。C-重复结合因子（CBFs）属于DREB亚家族，具有高度保守的AP2 DNA结合结构域及特征氨基酸序列PKK/RPAGR和DSAWRL。AP2结构域可结合冷调控（COR）基因启动子中的C-重复/脱水响应元件（CRT/DRE; G/ACCGAC），诱导COR基因表达以增强抗寒性。ERF转录因子则通过结合GCC-box调控乙烯响应基因的表达。

在拟南芥中，CBF基因家族包含四个成员，其中AtCBF1/DREB1C、AtCBF2/DREB1B和AtCBF3/DREB1A参与冷胁迫响应，而AtCBF4/DREB1D与干旱胁迫耐受相关。过表达AtCBF1、AtCBF2和AtCBF3可诱导COR基因表达并提升拟南芥的冷冻耐受性。CBF基因也在小麦、葡萄、番茄、棉花、杨树、桃和茶等多种植物中被鉴定并功能表征。冷胁迫可分为突然降温（冷激）和渐进降温（冷驯化）两种类型，CBF表达模式因植物种类、胁迫类型和持续时间而异。

芦笋是加拿大安大略省重要的多年生蔬菜作物，冬季常面临低于0°C的低温胁迫。田间研究表明，适应安大略条件的品种‘Guelph Millennium’（GM）比加州品种‘UC157’（UC）具有更高的冷冻耐受性。两者在秋季末期达到相近的抗寒水平，但GM在春季脱驯化较晚。先前研究还发现多个代谢物水平与品种间抗寒性差异相关。然而，芦笋冷胁迫响应的分子机制，尤其是CBF转录因子的作用尚未深入研究。

材料与方法

通过BLASTp比对拟南芥CBF蛋白序列 against 芦笋参考基因组v1.1，鉴定芦笋CBF同源基因。使用SMART和NCBI Batch CD-search确认AP2结构域，Clustal Omega进行多序列比对分析特征序列，MEME程序识别保守 motifs。植物材料为GM和UC品种，在温室25/22°C（昼/夜）条件下生长10周。冷激处理直接将植株从22°C转移至4°C培养2天；冷驯化处理采用渐进降温：12/8°C（4天）→4°C（6天）→0°C（4天）→-4°C（2天），每小时降温1°C。分别于不同时间点采集蕨叶、根茎（含芽）和贮藏根组织，液氮速冻后-80°C保存。使用TRIzol法提取总RNA，通过qRT-PCR分析基因表达，以ACTIN为内参基因，采用2^?ΔΔCt法计算相对表达量，统计学分析使用单因素ANOVA和Tukey HSD检验（P≤0.05）。

结果

鉴定芦笋中与拟南芥CBFs（AtCBFs）同源的基因

共鉴定出11个芦笋CBF同源基因，其中2个编码DREB蛋白，8个编码ERF蛋白，1个编码病原相关基因转录激活因子。SMART和Batch-CD搜索确认所有基因均含有AP2结合结构域。多序列比对显示芦笋基因AP2 DNA结合结构域与AtCBF家族高度同源，但仅两个DREB基因（A4U43_C05F4770和A4U43_C02F3280）含有PKK/RPAGR特征序列，仅A4U43_C02F3280具有DSAWRL特征序列。Motif分析识别出8个保守 motifs，其中motif 1为AP2结构域，高度保守于所有基因；motif 7和8仅存在于芦笋DREB基因中，且motif 7包含PRKPAGK结构域。

冷激和驯化处理下芦笋CBF同源基因的表达

冷驯化处理中，A4U43_C02F3280（DREB2C）基因在GM和UC的蕨叶、根茎和贮藏根中均上调表达，且随温度降低表达量增加，-4°C时达到最高。蕨叶表达水平最高（蕨叶 > 根茎 > 贮藏根）。冷激处理下，DREB2C在蕨叶中5小时内诱导表达，根茎中24小时诱导，贮藏根中无响应。A4U43_C05F4770（DREB2B）基因在冷驯化中于蕨叶和根茎上调表达，8°C时最高，随后随温度降低而下降；冷激处理下，DREB2B在蕨叶中30分钟内快速诱导，根茎中5小时诱导，贮藏根中48小时诱导。三个ERF基因（ERF062、ERF109和ERF113）在两种冷处理中均下调表达。品种间比较显示，所有基因表达在GM和UC中无显著差异。

讨论

研究在芦笋中鉴定出11个AtCBF同源基因，其中DREB2C和DREB2B（DREB亚家族）在冷激和驯化处理中显著上调，而ERF062、ERF109和ERF113（ERF亚家族）显著下调。DREB基因含有CBF特征序列，而ERF基因缺乏这些序列。DREB2C和DREB2B在8°C冷驯化初期即被诱导，DREB2C在低温下持续高表达可能与冷冻耐受性增强相关。组织特异性表达显示蕨叶表达最高，与其直接暴露于冷环境相符，与拟南芥、桃和葡萄中的观察一致。

冷激处理下，DREB2B早于DREB2C被诱导（蕨叶30分钟 vs 5小时），符合多年生植物CBF基因持久诱导的特征（如苜蓿48小时、柑橘4天、葡萄5天）。冷驯化比冷激引发更强烈持久的DREB表达，表明CBF基因在芦笋冷响应中起核心调控作用。尽管GM和UC抗寒性不同，但CBF候选基因表达无品种差异，提示抗寒性差异可能源于CBF下游的翻译后调控机制（如蛋白磷酸化、染色质重塑）或CBF非依赖转录因子调控。ERF基因下调可能负向调控DREB表达，与水稻中ERF096负调CBF基因的机制类似。

综上所述，DREB2C和DREB2B是芦笋中重要的CBF候选基因，其强冷响应性表明在冷胁迫中发挥关键作用，而ERF基因可能通过负向调控参与冷响应。需进一步实验验证这些基因是否完全功能化为经典CBFs或与DREB亚家族其他成员功能重叠。