基于微滴式数字PCR（ddPCR）检测硬质小麦粗粒粉与面食中普通小麦及大豆污染物的精准定量研究

本文开发并验证了利用ddPCR技术检测硬质小麦产品中普通小麦（0.5%–55%）及大豆（0.01%–5%）污染的高灵敏度方法，通过基因组特异性标记（如1D5/2A1、Lec1）和校正常数（?、ε、φ）消除DNA提取效率、基因组大小（GS）及千粒重（TKW）差异的干扰，为谷物质量监控与食品安全保障提供了分子诊断新工具。

　　

引言

硬质小麦（Durum wheat）是全球食品供应链中的重要谷物，主要用于生产面食和粗粒粉（semolina）。其在加工过程中的品质受蛋白质含量、黄色素及污染物（如普通小麦和大豆）的显著影响。加拿大作为主要生产国，其谷物分级系统允许最高2%的其他小麦类别及0.2%的非谷物杂质，但加工端需更精准的监控手段。污染物可能改变终端产品的功能特性（如普通小麦导致面食色泽变浅、质地软化），大豆中的脂氧合酶（lipoxygenase）则会降解色素并引入过敏风险。传统肉眼检测在谷物粉碎后失效，因此需依赖DNA分子技术实现精准定量。

材料与方法

样本制备：

研究使用2017年度货船样本及2022–23年度独立验证样本，包括加拿大西部琥珀杜伦麦（CWAD）与红色春小麦（CWRS）等类别。通过重量比例混合（普通小麦0.5%–55%，大豆0.01%–5%），经Cyclone Sample Mill粉碎后，使用四联Allis-Chalmers实验磨制备粗粒粉，并通过微型挤压机生产意大利面。样本均经Retsch ZM200超离心磨进一步细化至0.5 mm粒径以确保DNA提取均一性。

DNA提取与处理：

采用Qiagen Tissue Lyser II与不锈钢研磨球对200 mg样本进行粉碎，参照Perry和Lee（2017）的流程提取DNA，并通过PicoGreen?荧光染料定量。为提升ddPCR效率，DNA溶液（50–80 ng/μL）经30 Hz频率机械剪切10分钟，产生4000–8000 bp片段（图1），其效果媲美HydroShear?但产量更高（附图S1）。

物种特异性引物与探针：

针对普通小麦与硬质小麦的区分，开发了三个基因组特异性标记：

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  1D5（染色体1D）：FAM标记探针，用于检测普通小麦特有的D基因组；

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  2A1（染色体2A）与4B9（染色体4B）：VIC标记探针，作为硬质小麦与普通小麦的共同内参。

  大豆检测采用Lec1（lectin 1）基因的FAM标记探针，其与硬质小麦的2A1或4B9组成双重复合体系。

ddPCR检测流程：

反应体系包含1× ddPCR Supermix、引物（1.0 μmol/L）、探针（0.2 μmol/L）及模板DNA（粗粒粉400 ng，面食40–60 ng）。经AutoDG生成微滴后，进行45循环扩增（95°C 15 s，56°C 90 s）。通过QX200微滴读取器统计FAM（n_F）、VIC（n_V）、双阳性（n_VF）及阴性微滴数，并通过Poisson校正计算目标序列拷贝数（λ_F = ?ln(1 ? (n_F + n_VF)/N)）。

污染定量与校正常数计算：

为消除基因组大小（GS）、千粒重（TKW）及DNA提取效率差异的影响，研究引入两类校正常数：

1. 1.

   经验校正常数（I与III）：通过已知比例混合样本的ddPCR数据与实际污染水平的偏差计算得出（公式1、5）。普通小麦的常数?（I）平均为0.560（1D5/2A1）和0.518（1D5/4B9），大豆的常数φ（III）平均为9.20–10.66；

2. 2.

   理论校正常数（II）：基于GS（硬质小麦11 Gb、普通小麦16 Gb、大豆1.1 Gb）与TKW（CWAD 38.5 g、CWRS 34.7 g）的比例推导（公式3），普通小麦的ε（II）计算为0.539。

   最终污染水平通过校正公式（2、4、6）转换为质量百分比。

结果

DNA剪切提升扩增效率：

未剪切DNA中，FAM信号（1D5）占比仅39.2–41.2%，低于VIC信号（60.7–58.8%），表明长链DNA存在扩增偏差。剪切后FAM比例升至48.5–49.2%，接近理论50%均衡（表1），证明剪切显著改善ddPCR的定量准确性。

普通小麦污染定量需校正常数：

使用校正常数I与II后，粗粒粉与面食中普通小麦的检测结果与真实添加水平高度吻合（表3）。其中1D5/4B9组合表现最佳，而1D5/2A1在面食样本中略高估35%，可能与面食DNA提取量低、剪切程度高有关。值得注意的是，最高等级硬质小麦本身含0.9–2.1%的背景污染，符合分级允许范围。

大豆污染检测灵敏度极高：

在0.01%–5%的添加范围内，校正常数III（φ）计算的污染水平与真实值高度一致（表4）。当污染浓度达5%时，常数略有上升（13.69–13.91），可能与大豆高蛋白高油脂导致的DNA提取率下降有关。但在实际低污染场景（≤1%）下，该方法仍具卓越准确性。

讨论与结论

本研究建立的ddPCR方法通过基因组特异性标记（如1D5、Lec1）与校正常数（?、ε、φ），成功解决了因GS、细胞数量及提取效率差异导致的定量偏差问题。相较于蛋白质组学或传统PCR，ddPCR具备超高灵敏度与精准性，可适用于加工食品（如面食）中微量污染物的监控。

普通小麦与大豆的污染不仅影响终端产品品质（如色泽、质地），还可能引入过敏风险。该方法为行业监管与政策制定提供了可靠工具，未来可扩展至其他谷物污染物检测领域。通过机械剪切优化DNA模板，进一步提升了ddPCR的重复性与稳定性，使其成为粮食安全质量保障体系中不可或缺的分子诊断技术。