二甲双胍重塑肠道菌群通过肠-脾轴逆转老年小鼠脾脏免疫衰老：微生物组与免疫的对话

本研究发现二甲双胍通过重塑肠道菌群（如富集Akkermansia、Muribaculum，减少Lactobacillus），调控肠-脾轴，逆转老年小鼠脾脏免疫衰老：增加细胞毒性T细胞（Tc）和M2巨噬细胞，降低Th/Tc和M1/M2比率，抑制促炎因子（Ifng、Il17a、Il1b、Il6），提升抗炎标志物（Arg1、Tgfb1）。研究确立了肠-脾轴为免疫衰老的关键调节靶点，为二甲双胍作为菌群导向的老年保护剂提供了新机制。

　　

背景与目的

免疫衰老涉及年龄相关的免疫衰退和慢性炎症，脾脏作为免疫失调的关键枢纽发挥着核心作用。虽然肠道菌群影响全身免疫，但其在脾脏衰老中的具体作用及潜在的肠-脾轴机制尚不明确。因此，本研究探讨二甲双胍——一种调节微生物组的老年保护药物——是否能缓解老年小鼠的脾脏免疫衰老，特别关注肠道菌群重塑与脾脏免疫 rejuvenation 之间的联系。

方法

研究使用15月龄的C57BL/6雄性小鼠，分为对照组（CON，n=11）和二甲双胍处理组（TEST，n=11），后者每日口服300 mg/kg二甲双胍，持续5个月。监测系统毒性和代谢指标，采用流式细胞术和免疫组化分析脾脏免疫细胞亚群，通过16S rRNA测序评估肠道菌群组成，利用RT-qPCR检测细胞因子水平，并预测功能通路。

结果

二甲双胍未引起肝肾毒性或体重变化。处理组小鼠脾脏中细胞毒性T细胞（Tc）和巨噬细胞增加，Th/Tc比率和M1/M2极化降低。促炎细胞因子（Ifng、Il17a、Il1b、Il6）减少，而抗炎标志物（Arg1、Tgfb1）升高。肠道菌群显示Akkermansia、Muribaculum和Duncaniella富集，但Lactobacillus减少。Akkermansia/Muribaculum与促炎细胞因子负相关，而Lactobacillus和Lachnospiraceae与促炎反应相关。基于16S rRNA测序数据的功能预测分析表明，胆汁酸代谢和氧化磷酸化通路上调。

讨论

本研究提供有力证据表明，长期二甲双胍给药主要通过调节肠道菌群改善老年小鼠的脾脏免疫衰老。通过整合微生物组和免疫分析，我们描绘了二甲双胍、肠道微生物群落和脾脏免疫微环境之间的三元关系，为免疫衰老中的肠-脾轴提供了新见解。

数据揭示二甲双胍通过增强细胞毒性T细胞（Tc）和巨噬细胞群体，同时抑制促炎M1极化来抵消这些变化。Tc比例的增加与先前研究一致，显示二甲双胍通过AMPK介导的代谢重编程增强CD8⁺ T细胞反应。同时，从M1向M2巨噬细胞的转变强调了二甲双胍的抗炎作用，与其已知的NLRP3炎症小体激活抑制一致。这些发现共同凸显了二甲双胍在老年脾脏中增强适应性免疫（通过Tc扩张）和缓解炎症（通过巨噬细胞重极化）的能力。

本研究的一个关键新颖之处在于将二甲双胍诱导的肠道菌群变化与脾脏免疫重塑联系起来。Akkermansia muciniphila的富集——一种与改善肠道屏障完整性相关的黏液降解细菌——与减少系统性炎症和增强短链脂肪酸（SCFA）生产相关，这可能促进T细胞分化和巨噬细胞稳态。相反，Lactobacillus比例的减少——传统上被视为有益菌属——在我们的模型中出乎意料，这可能表明菌株特异性效应或背景依赖性，潜在解释了在老年宿主中与抗炎标志物的负相关和与Th17反应的关联。Muribaculum和Duncaniella的增加——两者都与碳水化合物代谢相关——与二甲双胍增强微生物丁酸盐合成的能力一致，丁酸盐是Treg/Th17平衡的已知调节剂。值得注意的是，微生物类群与免疫参数之间的 divergent 相关性（例如Akkermansia与抗炎细胞因子，而Lactobacillus与促炎标志物）表明在免疫衰老中复杂的类群特异性作用。这种二分法可能源于微生物群落内的功能冗余或与宿主免疫的背景依赖性相互作用。

重要的是，我们在老年小鼠模型中观察到的关键微生物变化——特别是Akkermansia和Escherichia的富集，以及某些Lactobacillus物种的减少——与人类二甲双胍研究的结果强烈共鸣。例如，人类肠道宏基因组的大规模整合分析一致报告二甲双胍诱导Akkermansia muciniphila丰度增加。同样，我们小鼠中Escherichia的增加反映了在二甲双胍治疗的T2D患者中的观察，其中Escherichia coli丰度的增加与胃肠道副作用机械相关，但也可能涉及微生物 agmatine 生产。最近的人类研究进一步表明，二甲双胍抑制微生物酶 agmatinase 会提高 agmatine 水平，这是一种代谢物，暗示增强宿主脂肪酸氧化——一个可能支撑我们脾脏表型中Tc细胞代谢适应性的过程。此外，类似于我们 linking Muribaculum 与改善代谢指标的相关性，人类研究显示二甲双胍富集黏液降解和SCFA生产类群（包括Muribaculaceae家族的相关成员），有助于改善葡萄糖稳态和免疫调节。这些跨物种保守的微生物特征，包括Akkermansia和Escherichia的增加以及Lactobacillus的减少，强调了肠道菌群介导机制在二甲双胍免疫代谢作用中的可翻译性，强化了我们小鼠模型与人类病理生理的相关性。

PICRUSt2预测的功能改变进一步支持了微生物群驱动的机制。氧化磷酸化通路的富集反映了二甲双胍的线粒体效应，表明宿主和微生物代谢之间的共生关系。增强的胆汁酸代谢，特别是涉及次级胆汁酸（SBA），作为肠道菌群与宿主之间的关键通信途径。SBA如脱氧胆酸（DCA）和石胆酸（LCA）通过微生物生物转化产生，作为有效的信号分子激活宿主受体（FXR、TGR5），在包括脾脏、肝脏和大脑的系统组织中表达。TGR5激活触发cAMP-PKA信号，促进NLRP3炎症小体降解和抑制IL-1β释放。例如，微生物DCA通过TGR5-cAMP-PKA-NLRP3通路缓解炎症，而TGR5受损则加剧炎症。因此，SBA作为重要的微生物-宿主信使，通过FXR/TGR5依赖的NLRP3调节桥接肠道菌群活动与系统免疫。这一轴代表了免疫代谢平衡的关键机制。相反，错配修复通路的下调可能反映了减少的基因组不稳定性。

我们的发现补充了将肠道菌群变化与系统衰老结果联系起来的 multi-omics 研究。虽然先前的工作专注于肝脏、大脑或代谢，但我们的研究 specifically 将二甲双胍诱导的微生物重塑（Akkermansia、Muribaculum的富集；Lactobacillus的减少）映射到衰老中定义的脾脏免疫表型（增强的Tc、M2极化）。此外，二甲双胍直接通过磷酸转移酶系统（PTS）和Crp重编程细菌代谢，导致 agmatine 积累。细菌衍生的 agmatine 对于二甲双胍诱导宿主脂肪酸氧化（FAO）至关重要——一种由NHR-49/PPARα等因素调节的代谢转变，提供能量和信号分子，可能驱动观察到的脾脏免疫表型，包括增加的Tc活性和抗炎巨噬细胞极化。

虽然我们的发现与二甲双胍 documented 的抗炎特性一致，但一些观察与早期研究不同。例如，二甲双胍未能上调Foxp3（一种Treg标志物）与其在脂肪组织中报告诱导Tregs形成对比，可能由于组织特异性表观遗传 regulation 或老年与肥胖模型中不同的微生物群。类似地，B细胞群体缺乏变化与二甲双胍在疫苗接种模型中报告的增强体液免疫相矛盾。这种差异可能源于与年龄相关的B细胞基本改变：免疫衰老涉及减少的初始B细胞输出、衰竭/年龄相关B细胞（ABCs）的积累、受损的生发中心形成和减弱的抗原反应性——所有都与我们的基线免疫衰老表型一致。二甲双胍 documented 的B细胞效应主要发生在具有完整B细胞受体信号和功能Tfh细胞的年轻/成人模型中，这些机制在衰老中受损。此外，我们的相关分析显示二甲双胍改变类群与脾脏B细胞之间没有显著联系，表明衰老中的微生物组-免疫轴可能优先调节T细胞/巨噬细胞通路。

关键的是，我们的发现表明二甲双胍的脾脏免疫调节可能通过肠-脾轴介导。Akkermansia和Muribaculum的富集与增加抗炎M2巨噬细胞相关，与证据一致，即Akkermansia衍生的细胞外囊泡（EVs）进入循环，直接调节脾脏免疫细胞。减少的Lactobacillus丰度可能通过改变胆汁酸代谢调节脾脏免疫。二甲双胍抑制胆汁酸重吸收，增加远端肠道胆汁酸，并提高循环结合胆汁酸。这些胆汁酸作为FXR拮抗剂抑制脾脏Th17分化。

肠-脾串扰可能解释Lachnospiraceae减少尽管其丁酸生成潜力。二甲双胍抑制一些丁酸盐生产者（例如Fecalibacterium）但富集其他如Duncaniella，可能 favor 醋酸盐生产。醋酸盐可以通过组蛋白去乙酰化酶抑制增强脾脏Tc细胞毒性。此外，二甲双胍抑制微生物 agmatinase 提高 agmatine，一种代谢物抑制巨噬细胞极化和T细胞反应。尽管相关数据 alone 不能明确建立功能性串扰，我们的整合数据集支持这一假设。

因此，本研究有几个值得考虑的局限性。首先，虽然我们的相关分析和功能预测表明二甲双胍诱导的微生物群改变可能有助于脾脏免疫重塑，但必须强调这些关联不 establish 因果关系。尽管FMT研究在糖尿病模型中确立了微生物群在介导二甲双胍代谢效应中的因果作用，但其在免疫衰老中的作用仍未探索。未来研究应采用从二甲双胍治疗的老年小鼠到未治疗对应物或无菌受体的粪便微生物移植（FMT）。这些实验对于直接确定微生物群转移是否重现观察到的免疫益处至关重要。此外，建议在后续研究中整合代谢物分析（例如SCFAs和胆汁酸）以识别连接微生物变化与脾脏免疫的介质。

其次，研究 exclusively 使用雄性小鼠是一个公认的局限性，因为性别二态性影响肠道菌群组成和免疫衰老轨迹。因此，我们的发现可能不推广到雌性。未来工作应包括雌性队列以评估二甲双胍对肠-脾轴的性别特异性效应，特别是考虑到激素对免疫代谢的影响。

第三，连接特定类群（例如Akkermansia）与脾脏Tc细胞的机制仍不清楚。肠道衍生免疫细胞的单细胞RNA测序可以阐明迁移模式和转录程序。

第四，本研究 exclusively 使用老年小鼠作为治疗和对照组，排除了与年轻成年免疫和微生物谱的直接比较。虽然这种设计稳健地证明了二甲双胍在衰老背景下的效应，但它不能描绘观察到的改善是代表恢复到年轻状态还是建立新的补偿平衡。我们通过将我们的老年对照数据与来自开创性文献的鼠类免疫衰老和年龄相关 dysbiosis 的既定基准进行背景化来减轻这种约束。然而，未来调查应纳入年轻成年对照以明确确定二甲双胍逆转——而不仅仅是 attenuate——衰老相关衰退的能力。

第五，虽然我们记录了二甲双胍诱导的免疫细胞频率和细胞因子谱变化，但我们没有通过疫苗接种或病原体暴露功能性挑战免疫系统。因此，脾脏免疫景观的重塑是否转化为增强的功能性免疫，例如改善的抗体反应或病原体清除，仍然未知。未来研究纳入此类功能测定对于充分确定二甲双胍介导的免疫调节在衰老中的生理相关性至关重要。

第六，免疫衰老涉及中央（胸腺）和周围免疫的协调衰退。我们的研究专注于脾脏，因此没有评估二甲双胍对胸腺完整性或初始T细胞流出的潜在影响。因此，脾脏细胞毒性T细胞的扩张是源于增强的胸腺生成、周围扩张还是改变的存活仍不清楚。未来调查包括胸腺结构、T细胞受体 excision circles（TRECs）和 recent thymic emigrants 的详细表型分析将有助于描绘中央与周围机制的相对贡献。

第七，我们的发现特定于脾脏免疫微环境。鉴于淋巴器官的解剖和功能专业化，二甲双胍的效应可能在淋巴结（例如肠系膜与周围）或肠道相关淋巴组织（GALT）中不同。我们报告的微生物群驱动的免疫调节是否局限于脾脏或代表更广泛的系统效应仍有待确定。未来多个淋巴部位的比较分析对于绘制受二甲双胍影响的肠-免疫轴的完整解剖范围至关重要。

第八，与观察到的总T细胞群体变化一致，一个关键局限性是缺乏T细胞分化状态的高分辨率表型分析。免疫衰老不仅涉及总CD4⁺或CD8⁺ T细胞数量的变化，而且还有子集组成的基本转变——特别是初始T细胞（Tn）的损耗和记忆及衰老样效应细胞的积累。没有分析标志物，如CD45RA、CD44、CCR7和CD62L，以区分Tn、中央记忆（Tcm）、效应记忆（Tem）和终末分化效应（Temra）子集，我们不能明确表征二甲双胍扩张的Tc群体。未来多参数流式细胞分析对于确定这种扩张是否反映初始库的 rejuvenation、记忆子集的优先扩张还是改变的T细胞存活是必要的。

最后，将这些发现转化为人类需要在老年队列中验证，特别是考虑到种间微生物群差异。

从转化 perspective，我们的数据将二甲双胍定位为靶向代谢和免疫衰老的双重用途剂。肠道菌群变化，特别是Akkermansia富集，类似于热量限制（CR）效应，表明二甲双胍可能药理学上模拟CR。

肠-脾轴为组合疗法开辟了途径，例如二甲双胍与益生菌（例如Akkermansia muciniphila制剂）或 prebiotics 靶向Muribaculum相关通路，以协同增强老年人的免疫韧性。这可能允许剂量减少以最小化副作用。该轴还提供了一个生物标志物框架（例如循环微生物代谢物、通过成像的脾脏免疫细胞谱）用于监测疗效。

然而，必须承认重要的转化挑战。鼠类模型与人类在肠道菌群组成、免疫衰老模式和二甲双胍药代动力学方面表现出基本差异。这些种间差异在将我们的发现 extrapolate 到人类衰老时需要谨慎。参考临床前和临床药物开发中实验动物与人类之间剂量转换的方法，使用的二甲双胍剂量（300 mg/kg/天）转化为人类等效剂量（HED）约24.3 mg/kg（60kg成人约1,460 mg/天），在标准临床范围内，支持药理学相关性但需要人类验证。

为了桥接转化差距，我们提议：1）在老年人中进行纵向二甲双胍试验，配对粪便宏基因组学和免疫分析；2）对现有队列（例如NHANES）进行相关分析，检查二甲双胍使用、肠道菌群签名和年龄相关免疫标志物；和3）从二甲双胍治疗的老年供体到无菌小鼠的FMT研究以验证因果微生物群-免疫关系。此类方法将有助于确定这里观察到的肠-脾轴在人类衰老中是否保守，以及微生物群导向的签名是否可以作为二甲双胍老年保护功效的生物标志物。

结论

总之，本研究证明二甲双胍重塑肠道菌群，与缓解年龄相关脾脏免疫失调相关， favor 抗炎巨噬细胞极化和细胞毒性T细胞扩张。这些发现确立了肠-脾轴作为一个新的治疗靶点，并将二甲双胍定位为一种有前途的微生物群导向的老年保护剂。未来研究应优先研究肠-脾通信的机制解剖和二甲双胍老年保护功效在人类群体中的临床验证。