人源3D皮肤模型：重症自身免疫性大疱病血清学诊断的新型工具

本研究创新性地将人源3D皮肤模型引入自身免疫性大疱病（AIBDs）的血清学诊断领域，成功开发出符合3R原则（替代、减少、优化）的无动物源诊断平台。该模型在间接免疫荧光（IIF）检测中展现出比传统猴食管底物更高的诊断灵敏度（97%），能精准区分天疱疮（PV/PF）和类天疱疮（BP）的特异性荧光模式，为AIBDs的精准诊断提供了标准化、高灵敏度的新型解决方案。

　　

1 引言

自身免疫性大疱病（AIBDs）是一组由自身抗体介导的异质性疾病，其特征是皮肤和/或黏膜出现水疱或糜烂。该疾病主要分为两大类：天疱疮性疾病和类天疱疮型自身免疫性大疱病。天疱疮主要包括寻常型天疱疮（PV，占78-80%）、落叶型天疱疮（PF，约20%）、副肿瘤性天疱疮（PNP，约5%）和IgA天疱疮（1-3%）。这些疾病的共同特征是产生针对桥粒蛋白的自身抗体，导致皮肤和/或黏膜发生棘层松解和表皮内水疱形成。PF通常仅与抗Dsg1抗体相关，而PV患者可能表现出抗Dsg3抗体（黏膜主导型）或同时具有抗Dsg3和抗Dsg1抗体（黏膜皮肤型）。值得注意的是，部分天疱疮患者仅携带针对桥粒斑蛋白、桥粒芯胶蛋白或包斑蛋白的抗体，这些抗体目前无法通过市售ELISA试剂盒检测。

类天疱疮型自身免疫性大疱病主要包括大疱性类天疱疮（BP）、黏膜类天疱疮（MMP）和获得性大疱性表皮松解症（EBA）。这些疾病的标志是产生针对半桥粒蛋白（特别是BP230和BP180）的自身抗体，导致表皮下大疱形成。

AIBDs的诊断不能仅依靠临床评估，需要采用包括皮肤病学评估、组织病理学特征、直接免疫荧光（DIF）、间接免疫荧光（IIF）和酶联免疫吸附测定（ELISA）在内的多步骤诊断流程。DIF被认为是检测皮肤活检组织中结合抗体的金标准，而循环抗体则可通过ELISA和IIF检测。ELISA可对自身抗体进行定量分析，而IIF则使用动物组织（猴食管或大鼠膀胱）作为底物。在此背景下，重建的人源皮肤等效物代表了动物试验的替代方案，符合3R原则（替代、减少、优化），并提供了满足监管机构要求的新途径。

2 材料与方法

研究收集了34例患者的血清，包括寻常型天疱疮（3例）、落叶型天疱疮（5例）和大疱性类天疱疮（26例）。患者年龄介于41至94岁之间，其中女性18例，男性16例。作为常规诊断的一部分，对所有患者进行了DIF、ELISA和猴食管IIF检测，并记录了结果。此外，使用人源全皮肤3D皮肤模型的冰冻切片与患者血清一起进行IIF检测，并将这些结果与常规诊断结果进行比较。

3D皮肤模型的构建采用正常人表皮角质形成细胞（NHEK）和正常人真皮成纤维细胞（NHDF）。基于胶原的3D皮肤等效物按照先前描述的方法制备：首先通过混合八体积冰牛胶原I溶液、一体积10倍浓缩的Hank's平衡盐溶液构建真皮部分，中和后加入悬浮在FCS中的NHDF，最终凝胶溶液中NHDF浓度为2×10⁵个细胞/mL。将4毫升该凝胶溶液倒入每个聚碳酸酯膜插入物中，置于六孔板中。完全聚合后，用DMEM覆盖凝胶并在37°C、5% CO₂的湿润气氛中培养。次日，在每个真皮等效物上接种约2×10⁶个NHEK细胞，在37°C、5% CO₂下培养一天。随后，将3D皮肤模型提升至气-液界面并培养14天。培养完成后，将3D皮肤模型嵌入Tissue-Tek O.C.T.化合物中进行冰冻切片。

所有ELISA试剂盒均购自Euroimmun公司，并按照制造商的说明进行操作。使用针对人源抗桥粒芯糖蛋白1（Dsg1）和桥粒芯糖蛋白3（Dsg3）的ELISA试剂盒诊断寻常型天疱疮和落叶型天疱疮。对于大疱性类天疱疮患者，使用针对BP180和BP230的ELISA assay进行诊断。

DIF染色使用4μm切片，与荧光标记的抗人IgG、IgA和C3抗体一起孵育30分钟。免疫染色后，用PBS洗涤切片并在荧光显微镜下检查。

IIF检测使用NOVA Lite猴食管试剂盒按照制造商说明进行。猴食管载玻片与患者血清（1:10）和适当对照一起在室温下孵育30分钟。洗掉未结合的抗体后，加入抗人IgG荧光标记缀合物，在室温黑暗环境中孵育30分钟。使用人3D皮肤模型的IIF检测过程与上述完全相同，仅将猴食管载玻片替换为人3D皮肤模型的4μm冰冻切片。

3 结果

3.1 AIBD对照样品在人皮肤等效物上的染色与猴食管相同

初步评估表明，人源3D皮肤模型能够复现自身免疫性水疱病（AIBDs）诊断所需的特征性染色模式。使用天疱疮和类天疱疮阳性对照血清对3D皮肤模型组织切片进行免疫荧光染色，结果与猴食管载玻片获得的结果一致。天疱疮对照在猴食管和3D皮肤模型上均显示出预期的表皮细胞间染色。类似地，类天疱疮对照在两种底物上均表现出沿基底膜的清晰线性染色。阴性对照样品中未观察到染色。

3.2 人源3D皮肤模型在IIF中优于猴食管

随后使用人源3D皮肤模型对所有34例患者血清进行IIF检测，并与猴食管底物的结果进行比较。PV和PF患者血清在上皮内表现出特征性的细胞间网状染色模式（通常称为"鸡笼"或"蜂窝"模式），而类天疱疮患者血清则显示沿基底膜带的线性染色模式。这些疾病特异性染色模式在使用猴食管和人源3D皮肤模型作为底物时均被一致检测到。值得注意的是，3D皮肤模型切片中的荧光定位能够区分PV和PF血清，后者在表皮浅层表现出更强的信号。

诊断敏感性比较显示：对于寻常型天疱疮患者，所有常规诊断方法（DIF、ELISA、猴食管IIF）和新诊断测试系统（使用3D皮肤模型的IIF）均实现100%的诊断率。对于落叶型天疱疮患者，常规诊断的敏感性各不相同：DIF检测到100%，而ELISA和猴食管IIF各检测到60%。相比之下，使用3D皮肤模型的IIF显示出更高的敏感性，达到80%。在大疱性类天疱疮患者中，常规诊断通过DIF检测到100%，ELISA检测到85%，猴食管IIF检测到69%。而使用3D皮肤模型的IIF识别出所有BP患者，敏感性达到100%。

总体而言，这项可行性研究表明，使用不同的诊断方法检测AIBDs患者的敏感性各不相同：DIF达到最高敏感性100%，新型3D皮肤模型紧随其后，敏感性为97%，ELISA敏感性为82%，而使用猴食管底物的IIF显示最低敏感性，仅为71%。

4 讨论

AIBDs的诊断基于皮肤病学检查、皮肤病变活检的组织学分析、使用病灶周围活检的直接免疫荧光（DIF）以及通过酶联免疫吸附测定（ELISA）和使用猴食管作为底物的间接免疫荧光（IIF）进行血清检测，其中DIF被认为是诊断AIBD的金标准。然而，这些诊断方法各有局限性，必须组合使用以确保准确诊断和有效监测治疗反应。

常规IIF检测通常使用猴食管冰冻切片作为底物，用于检测针对表皮内抗原（天疱疮）或基底膜带成分（类天疱疮）的循环抗体。然而，伦理考虑促使人们越来越关注用基于人或合成的替代品取代动物源性组织，以符合3R原则（替代、减少、优化）。

本研究成功开发了基于人源组织的标准化体外诊断平台，作为猴食管在IIF检测中的替代品。人源3D皮肤模型代表了生理相关的体外系统，重现了人类皮肤的所有层次（真皮、基底膜和表皮），在组织结构、基因表达和代谢活性方面与天然皮肤高度相似。

研究证明，标准化3D皮肤模型的组织切片是猴食管在AIBDs诊断中的真正替代品。3D皮肤模型的切片始终显示出与猴食管相同的染色模式，每种模式都对应于相应的天疱疮或类天疱疮疾病组。更重要的是，3D皮肤模型的切片能够根据不同的荧光模式可靠地区分PV和PF：在PF中，荧光信号在表皮浅层明显更强，这与桥粒芯糖蛋白1（DSG1）主要表达的区域相对应。

与文献一致（文献报道DIF诊断AIBDs的敏感性高达91%），本研究使用DIF进行明确诊断，其敏感性达到100%。本研究中ELISA（82%）和使用猴食管的IIF（71%）的敏感性明显较低，但与先前公布的数据一致，从而加强了研究结果的有效性。与这些既定方法相比，3D皮肤模型的组织切片达到了97%的敏感性，显示出比猴食管更明显的诊断优势。

本研究的一个局限性是仅测试了确诊AIBD患者的血清。纳入健康个体和其他皮肤病患者的血清将有助于评估潜在的交叉反应和假阳性结果（即3D皮肤模型切片的特异性）。后续研究计划扩大AIBD血清队列并纳入更多阴性对照。另一个局限性是广泛应用的盐裂技术尚未在3D皮肤模型中成功实施，未来研究将致力于在该模型中建立这种方法。

总之，本研究证实3D人源皮肤模型的组织切片可作为检测AIBDs的新型体外诊断工具，为目前IIF中使用的动物源性底物提供了可行替代方案。这种用人源3D皮肤模型进行的替代不仅符合3R原则（替代、减少、优化），而且临床研究证明这种