园艺芦笋及其野生近缘种NLR基因家族的比较基因组学分析揭示驯化过程中免疫受体收缩与功能减弱的进化机制

本综述对园艺芦笋（Asparagus officinalis）及其野生近缘种（A. kiusianus和A. setaceus）的NLR（Nucleotide-binding leucine-rich repeat receptors）基因家族进行了系统性比较分析，揭示栽培种NLR基因数量显著收缩（27 vs 63/47）且保留基因在病原侵染后表达下调或不变，表明人工选择优先产量与品质导致免疫功能退化，为抗病育种提供重要理论基础。

　　

Introduction

园艺芦笋（Asparagus officinalis）作为国际市场上享有“蔬菜之王”美誉的重要经济作物，其可持续栽培常受到真菌病害的严重威胁。植物免疫系统中的核苷酸结合富亮氨酸重复受体（NLR）是抗病机制的核心组分，但在芦笋属中的进化规律和功能特性尚未系统阐明。本研究通过比较栽培种A. officinalis与野生近缘种A. kiusianus、A. setaceus的NLR基因，结合病原接种实验，旨在揭示栽培种感病性增强的遗传基础。

Materials and methods

研究采用HMMER和BLASTp双轨策略从三个物种基因组中鉴定NLR基因，通过InterProScan和CD-Search进行结构域验证，利用MEME进行保守模体分析，PlantCARE数据库预测启动子顺式作用元件。系统发育树采用最大似然法构建，共线性分析通过MCScanX完成。病原接种实验使用Phomopsis asparagi，通过RNA-seq和qPCR分析基因表达动态。

Results

Identification and characterization of the NLR gene family in the genomes of A. officinalis, A. kiusianus, and A. setaceus

研究共鉴定出A. setaceus（63个）、A. kiusianus（47个）和A. officinalis（27个）NLR基因，根据结构域组成分为CNL、RNL和NL三个亚家族。值得注意的是，单子叶植物中典型的TNL亚家族完全缺失。完整NLR（含NBS-LRR结构域）的数量在三个物种中分别为47、36和22个，其中NL亚家族数量呈现从栽培种到野生种的递增趋势（10→24→42），表明进化过程中N端结构域丢失事件频繁发生。

Chromosomal distribution of NLRs in A. officinalis, A. kiusianus and A. setaceus

NLR基因在染色体上呈不均匀分布且形成明显基因簇。A. officinalis的第9、10号染色体完全缺失NLR基因，而野生种所有染色体均含有NLR分布。RNL基因显示物种特异性分布模式：A. officinalis和A. kiusianus集中于4号染色体，A. setaceus分布于1号和8号染色体。亚细胞定位预测显示NLR蛋白主要定位于细胞核（56%、49%、31%）和细胞质（41%、39%、43%），符合NLR蛋白在胞内外协同防御的功能特征。

Conserved domains analysis of NLRs

结构域分析确认所有基因均含NB-ARC结构域，但仅有50个（36.8%）为典型完整结构。LRR结构域存在于77.9%基因中，CC和RPW8结构域分别占34.6%和9.6%，63.5%的基因缺失N端结构域。外显子-内含子结构分析显示大多数NLR基因具有长编码序列，少数由短CDS拼接而成。

Conserved motif analysis of NLRs

MEME鉴定出10个保守模体，其中模体7存在于所有CNL和RNL蛋白的N端，但在NL亚家族中部分缺失。不同亚家族内部模体组成高度保守，暗示功能特异性分化。

Promoter cis-element analysis of NLRs in A. officinalis, A. kiusianus, and A. setaceus

启动子顺式元件分析发现大量防御相关元件，包括茉莉酸甲酯响应元件（TGACG-motif和CGTCA-motif）、水杨酸响应元件（TCA-element）、防御应激响应元件（TC-rich repeats）和干旱诱导MYB结合位点（MBS）。激素相关元件占总数的80.8%，表明NLR基因表达受激素信号通路精密调控。

Phylogenetic analysis of NLRs in A. officinalis, A. kiusianus, and A. setaceus

基于NB-ARC域构建的系统发育树将NLR分为两大进化枝，其中CNL枝包含45.9%的基因且与RNL形成独立进化簇。值得注意的是，19个NL基因与CNL基因聚类，经LRR域系统发育验证确认这些基因源于CNL祖先基因的CC结构域丢失事件。共鉴定81个相邻NLR基因对，82.7%呈头尾排列方式（head-to-tail），显著高于随机期望（P=0.003），表明串联复制是NLR扩张的重要机制。

Natural and artificial selection may have driven the contraction of NLR family members in A. officinalis

共线性分析显示CNL和NL型基因在物种间具有高度保守的基因组排列，但A. officinalis中部分同源区块存在基因丢失。MCScanX分析表明栽培种缺乏全基因组复制（WGD）事件产生的NLR基因对，而A. setaceus保留2对古老WGD衍生的NLR基因。通过旁系同源基因分析鉴定出16对在驯化过程中保留的NLR基因，其分化时间介于7.17-30.31百万年前。Ka/Ks分析显示大多数基因对比值小于1，表明纯化选择在NLR基因进化中占主导地位。

Fungal resistance and A. officinalis retained NLR expression pattern in response to Phomopsis asparagi

病原接种实验显示显著表型差异：A. officinalis在3 dpi出现坏死病斑，11 dpi病斑融合，19 dpi茎秆萎蔫；而A. setaceus直至19 dpi仍无症状。转录组分析发现15个保留NLR基因中，仅Aof07053（1 dpi）和Aof07990（2 dpi）显著上调，Aof28500、Aof31150、Aof11395等基因表达下调。qPCR验证证实大多数基因表达无显著变化或下调，仅个别基因短暂诱导表达。

Discussion

本研究首次系统揭示芦笋属NLR基因家族的进化动态：从野生种到栽培种呈现显著基因数量收缩（63→47→27），且保留基因在病原侵染过程中响应乏力。基因分布显示染色体末端成簇特性，头尾排列的串联重复为重要进化策略。启动子元件富集激素响应元件，表明NLR表达受JA、SA等激素通路调控。共线性与选择压力分析表明栽培种NLR收缩可能与产量品质优先的人工选择相关，符合“生长-防御权衡”理论。保留NLR基因的纯化选择（Ka/Ks<1）说明其功能重要性，但表达响应缺陷提示调控机制可能发生改变。该研究为芦笋抗病育种提供了关键基因资源和进化理论基础，未来需通过遗传转化体系验证特定NLR基因的功能机制。