Caspase 9介导线粒体功能障碍的蠕虫幼虫阶段诱导细胞凋亡及其在脑囊尾蚴病神经炎症中的作用与机制研究

本综述系统阐述了猪带绦虫（Taenia solium）囊尾蚴退化过程中释放的囊泡液（CVF）通过激活Caspase 9介导的线粒体内在凋亡通路，诱导线粒体膜电位丧失及功能紊乱，进而驱动中枢与外周免疫细胞（如CD16+单核细胞、CD3+ T细胞和小胶质细胞）凋亡的分子机制。研究揭示了CVF中小分子成分（<30 kDa）的关键作用，并发现症状性神经囊尾蚴病（NCC）患者血清中FasL水平显著升高，与Caspase活性增强及线粒体凋亡通路激活密切相关，为理解NCC免疫病理机制及靶向凋亡通路治疗策略提供了重要依据。

　　

Introduction

神经囊尾蚴病（Neurocysticercosis, NCC）是由猪带绦虫（Taenia solium）幼虫囊阶段引起的人畜共患寄生虫病，是撒哈拉以南非洲、拉丁美洲和东南亚等流行地区获得性癫痫的主要原因。NCC的发病机制与中枢神经系统（CNS）中囊尾蚴的存活和退化状态密切相关：存活囊虫通常通过调节性T细胞（Tregs）维持免疫耐受，导致无症状或轻度疾病；而囊虫退化和死亡则会引发显著的炎症反应，常导致症状性NCC，表现为癫痫发作、慢性头痛和神经炎症。然而，退化囊虫调节免疫反应并促进神经炎症的确切细胞和分子机制尚不完全清楚。本研究旨在探讨凋亡通路在调控这些过程中的作用。

宿主对NCC的免疫反应涉及脑内常驻细胞（如小胶质细胞和星形胶质细胞）与激活及浸润的外周免疫细胞（如单核细胞及其衍生的巨噬细胞、T细胞）之间的复杂相互作用。近期研究表明，小胶质细胞作为静息CNS中最常见的单核细胞，在识别和响应退化囊虫材料中发挥核心作用，通过分泌促炎介质（TNFα、IFNγ、IL-1β、IL-18、IL-12）和吞噬受损神经元及神经毒性聚集体，潜在地塑造神经免疫微环境并维持神经组织稳态。此外，在NCC中观察到系统性免疫失调，包括单核细胞和淋巴细胞的招募、激活和凋亡，表明寄生虫衍生因子可能影响免疫细胞的存活和功能。虽然先前的研究强调了细胞因子风暴、囊虫相关的机械和突触阻塞在NCC相关神经炎症中的主要作用，但凋亡通路，特别是Caspase依赖性信号传导在疾病进展中的贡献尚未完全阐明。

凋亡是调节性细胞死亡中最被充分理解的形式，对许多重要生物过程至关重要，如胚胎发育、细胞稳态维持和T淋巴细胞的负选择。因此，它是调控免疫稳态和病原体清除的基本机制。凋亡由两条主要通路 orchestrate，这两条通路在寄生蠕虫感染中均有发现：外在通路和内在通路。外在通路由死亡受体（如Fas和TNF受体超家族成员）的激活介导。内在线粒体通路则通过细胞应激源（如缺氧或热休克）诱导，并受到促凋亡和抗凋亡Bcl-2家族蛋白平衡的严格调控。内在通路对CNS病理尤为关键，因为线粒体功能障碍、Caspase 9激活和系统性免疫细胞凋亡增加在神经退行性疾病和CNS炎症反应中均有涉及。因此，彻底表征囊虫调节的中枢和外周细胞凋亡并解析其分子特征，特别是与Caspase驱动的线粒体功能障碍相关的部分，显得至关重要。

我们先前的研究表明，退化囊虫促进小胶质细胞和巨噬细胞的激活和凋亡，但对外周免疫细胞的影响和确切的分子触发因素仍未确定。本研究旨在定义参与NCC发病机制的凋亡信号通路，重点关注Caspase介导的线粒体功能障碍的作用。通过结合体外细胞实验、Caspase活性分析、基于质谱的蛋白质组学、动物感染和患者血清分析，我们表征了在存活与退化囊虫存在下引发的差异免疫反应和凋亡。我们进一步研究了囊虫分子对凋亡基因（如Bid、Bcl2）的调控，并通过分析症状性和无症状NCC患者中Caspase 3、8、9活性及与FasL水平的关联，提供了对NCC发病过程中内在与外在凋亡通路相对贡献的见解。

Materials and methods

Animals and T. solium cyst products

C57BL/6小鼠从Envigo（德国）购买或在内部繁殖，并在慕尼黑工业大学医学微生物学、免疫学和卫生学研究所（MIH）的动物设施中在无特定病原体条件下维持。所有实验均根据当地政府机构（Regierung von Oberbayern，Az. 55.2-1-54-2532-145-17）的批准进行。囊泡液（CVF）的制备如先前所述。猪带绦虫囊虫从赞比亚大学兽医学院一头重度感染猪的肌肉组织中收集（伦理批准Ref. 2018-Mar-002/0005948）。收集后，囊虫用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤。对于CVF制备，囊虫转移至无菌培养皿中，用手术刀切开，收集释放的液体。收集的液体通过0.45 μm过滤器无菌过滤，在4 °C下以15,000 g离心60分钟。随后，材料立即用苯甲基磺酰氟（PMSF，终浓度5 mM）和亮抑酶肽（终浓度2.5 μM）处理，并在PBS中以1 mg/ml的浓度分装。所有制备的材料均进行内毒素测试（水平<0.05 EU/ml），并在-80 °C储存直至使用。

Human PBMC and plasma from patients with NCC and controls

检查了来自健康对照者和NCC患者的人血浆中的可溶性凋亡诱导介质。患者是在TOPANA研究（一项在坦桑尼亚农村实施的前瞻性队列研究）中招募的。该研究获得了慕尼黑工业大学Klinikum Rechts der Isar伦理委员会（Reference 33/19S）和坦桑尼亚国家健康研究伦理委员会（NatREC）（Reference NIMR/HQ/R.8c/Vol.I/1808 for TOPANA and NIMR/HQ/R.8a/Vol.IX/2597 for SOLID）的伦理批准。研究方案和设计已 elsewhere 发表。简要来说，患者在三个地区医院（Tosamaganga、Chunya、Vwawa）招募。NCC诊断于2021年7月根据最新的Del Brutto标准进行，使用计算机断层扫描（CT）和实验室测试（LDBio囊尾蚴病Western Blot IgG、apDia Cysticercosis Ag-ELISA）。NCC患者通过存在或曾有严重进行性头痛和/或癫痫发作史，并具有实质内和实质外NCC伴有活动性病变和 mostly 退化/钙化囊虫，被分类为症状性。无症状NCC患者无癫痫发作和/或严重进行性头痛史，但具有存活和退化囊虫的混合，其中大多数为存活囊虫。参与者通过血清学检测HIV、痰中结核分枝杆菌、粪便中类类圆线虫，并根据IDSA/ASTMH建议进行眼底镜检查以排除眼NCC。从研究参与者采集血样并获得知情同意后，分离外周血单核细胞（PBMC）如先前所述。使用密度梯度离心（700 x g，25分钟，20 °C）从血液细胞成分中分离血浆，并在-80 °C储存直至使用。队列包括未感染NCC的坦桑尼亚个体作为对照（组1）、无症状NCC个体（组2）和伴有癫痫和/或严重进行性头痛的症状性NCC患者（组3）。本研究中的参与者年龄和性别匹配。

Human cell isolation from healthy volunteers, stimulation, and analysis

该研究获得慕尼黑工业大学当地伦理委员会批准（Reference: 215/18S），所有纳入研究的个体均同意参与。从混合性别的健康志愿者全血样本中，使用密度梯度离心分离人PBMC，并在液氮中储存如所述。从新鲜分离的人PBMC中使用Miltenyi Pan Monocyte Isolation Kit, human（Miltenyi, Germany, Cat. No. 130-096-537）纯化人未标记单核细胞，根据制造商协议进行。单核细胞纯度通常≥80%。将2.5x10⁵个细胞每孔铺在96孔U底板中，用CVF（0.01 – 5 μg/ml）刺激，并在37 °C、5% CO₂下孵育0–72小时。使用Staurosporine（TOCRIS, Bio-techne, Cat. No. 1285）（100 nM或500 nM）诱导凋亡。孵育期后，通过流式细胞术在CytoFLEX S（Beckman Coulter）上分析表面标志物（CD3、CD4、CD8、CD14、CD16（所有抗体来自Biolegend: Cat. No. 317331, 317433, 344723, 325607, 302025））。通过Annexin V/PI kit（Biolegend, Cat. No. 640914）测定早期凋亡（Annexin V⁺/PI^-）、晚期凋亡（Annexin V⁺/PI⁺）和坏死（Annexin V^-/PI⁺）细胞群体。对于细胞内染色，细胞用BD Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences, Cat. No. 554714）固定和透化，以检测活性Caspase 3（BD Pharmingen, Cat. No. 570332）。使用FAM FLICA? Caspase-8 and Caspase-9 Kits（Bio-Rad, Cat. No. ICT099, ICT912）检测活性Caspase 8和9。

Column fractionation and CVF-fragment induction of apoptosis

为确定CVF中蛋白质在诱导PBMC凋亡中的作用，通过热灭活（使用56 °C 1小时、56 °C 3小时、99 °C 1小时和99 °C 3小时）和10μg/ml Proteinase K（Sigma-Aldrich, Cat. No. P2308）在37 °C、5% CO₂下消化过夜，灭活CVF中的活性蛋白质。进行SDS page和考马斯亮蓝染色以确认有效的蛋白质灭活。CVF另外用半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64（Sigma-Aldrich, Cat. No. E3132）10μM处理1小时以抑制半胱氨酸蛋白酶（如组织蛋白酶）。蛋白质灭活和蛋白酶抑制后，用2.5 μg/ml预处理的CVF刺激PBMC 72小时，并使用Annexin V/PI评估凋亡诱导。此外，使用30 kDa柱分馏（GE Healthcare, Cat. No. 17VS50039A）根据分子大小分离CVF。使用流通和阻滞的CVF fractions（<30 kDa、>30 kDa）刺激PBMC，并检测凋亡。

Mitochondrial function and membrane potential evaluation

为测量线粒体损伤，用Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate（TMRE）（ThermoFisher Scientific, Cat. No. T669）和MitoTracker染色PBMC， following CVF刺激。对于TMRE染色，将TMRE在RPMI（Merck, Cat. No. R0883）（10% FCS（Merck, Cat. No. S0615）和1% Penicillin/Streptomycin（Merck, Cat. No. P4333）和cyclosporin H（Enzo, Cat. No. 83602-39-5）（终浓度0.5 μM）中稀释至10nM，并与CVF处理的PBMC在37 °C孵育30分钟以评估线粒体跨膜电位的损失。对于MitoTracker染色，将PBMC与MitoTracker Deep Red FM（ThermoFisher Scientific, Cat. No. M46753）和MitoTracker Green FM（ThermoFisher Scientific, Cat. No. M7514）在PBS中于37 °C孵育60分钟，以分别评估线粒体电位和质量损失。

Porcine cell isolation, stimulation, and analysis

从当地屠宰场新鲜屠宰的猪获取猪血样本。血液收集在含有1g EDTA（乙二胺四乙酸）抗凝剂的500 ml瓶中。样本在收集后一小时内于4 °C储存，并在24小时内处理。

使用SepMate? isolation tubes（Stemcell Technologies, Cat. No. 85460）和Histopaque^?-1077（Merck, Cat. No. 10771）分离猪PBMC。血液首先用无菌PBS/2%胎牛血清（FCS）（Merck, Cat. No. S0615）按1:1稀释，然后 layered onto Histopaque within 离心管中。使用密度梯度分离PBMC。离心在700xg进行25分钟，采用最低加速和 brake。使用一次性移液器收集PBMC层。用PBS + 2% F洗涤PBMC两次。使用0.5 ml红细胞裂解缓冲液（0.01 M KHCO₃、0.155 M NH₄Cl、0.1 mM EDTA）每10 ml血液在室温下裂解剩余红细胞4分钟。

将PBMC重悬于补充有10% FCS（Merck, Cat. No. S0615）、100 U/ml penicillin、100 μg/ml streptomycin（Merck, Cat. No. P4333）的RPMI（Merck, Cat. No. R8758）中。使用autoMACS separator（Miltenyi Biotec）从新鲜分离的PBMC中分离猪单核细胞。来自每只动物的PBMC在autoMACS running buffer（Miltenyi Biotec, Cat. No. 130-091-221）中重缓冲。用CD14 MicroBeads（Miltenyi Biotec, clone Tük4, Cat. No. 130-050-201）标记细胞，并根据制造商说明进行分离。将CD14⁺单核细胞沉淀并重悬于RPMI中。使用台盼蓝染色和自动细胞计数测定存活单核细胞和PBMC的数量。

将2.5–5 x 10⁵个猪PBMC细胞和3 x10⁵个猪单核细胞每孔铺板，并用2.5 μg/ml CVF在37 °C和5% CO₂下刺激0–72小时。孵育后，使用猪特异性抗CD4α（clone 74-12-4, mouse IgG2b, inhouse + anti-mouse IgG2b, clone R12-3, BD Biosciences, Cat. No. 743177）、抗CD8α（clone 11/295/33, mouse IgG2a, inhouse + anti-mouse IgG2a, clone RMG2 A-62, BioLegend, Cat. No. 407117）、抗CD3e（clone BB-23-8E6-8C8, BD Biosciences, Cat. No. 743177）、抗CD172a（clone 74-22-15, mouse IgG1, inhouse + anti-mouse IgG1, clone X-56, Miltenyi, Cat. No. 130-096-593）和CD14（clone Tük4, Bio-Rad, Cat. No. MCA1568P647）抗体在Attune NxT Flow cytometer（Thermo Fisher Scientific）上表征细胞群体。使用Annexin V/PI kit（Invitrogen, Cat. No. 13242）检测凋亡诱导，Staurosporine（500 nM）（Sigma-Aldrich, Cat. No. S6942）作为阳性对照。

Immunohistology of naturally infected pig brain slices

从农村饲养者购买十头2-4岁猪（6雌性和4雄性，4未感染和6自然感染猪带绦虫囊尾蚴病）。通过舌检诊断囊尾蚴病。根据墨西哥官方标准NOM-033-SAG/ZOO-2014，在兽医学院和动物技术学院人道处死动物。安乐死后立即采集血样，并解剖脑组织。脑样本在中性缓冲10%福尔马林中固定48小时。脱水后，脑组织包埋在石蜡块中。

使用旋转切片机（ThermoFisher Scientific, Cat. No. HM355S）将2μm切片的连续切片 mounted on Superfrost（HE）或Superfrost Plus（IHC）载玻片上。切片用苏木精-伊红染色，以使用标准方案评估一般病理变化。简要来说，用二甲苯去除蜡，然后通过不同浓度的酒精去除二甲苯。用蒸馏水 rehydration 后，用苏木精染色8分钟。用自来水冲洗后，用1%酒精伊红复染4分钟。通过不同浓度的酒精脱水载玻片，并用二甲苯澄清。

为可视化和定位猪脑中猪带绦虫囊虫周围肉芽肿区域中的细胞群体，使用自动染色仪（Bond RXm system, Leica）进行免疫组织化学（IHC）染色。简要来说，切片用Leica Kit de-wax（Leica, Cat. No. AR9222）脱蜡，并通过递减酒精浓度洗涤 rehydrated。使用柠檬酸盐缓冲液（pH=6）热诱导进行表位 retrieval 20分钟（抗CD79a为40分钟）。通过孵育切片与3%过氧化氢（Leica）5分钟阻断内源性过氧化物酶活性，并用正常山羊血清（Abcam, Cat. No. ab138478）阻断非特异性结合位点。然后添加一抗至切片15分钟室温（抗CD3（Cellmarque, Cat. No. MRQ39）、抗CD79a（ThermoFisher, Cat. No. HM57）、抗Iba1（poly, Wako, Cat. No. 019-19741）和抗Caspase 3（Cell Signaling, Cat. No. 5A1E））。使用聚合物 refine detection kit（Leica, Cat. No. DS9800）进行抗体检测，并使用二氨基联苯胺（DAB）（Merck, Cat. No. D12384）进行可视化。切片用苏木精复染10分钟，并通过递增酒精浓度和二甲苯脱水。使用Pertex mounting medium（Histolab, Cat. No. SEA-0100-00A）封片。所有抗体均测试了与猪的交叉反应性，并在每次染色运行中使用 adequate 阳性对照。

Analysis of histological pig brain slides

在 board-certified 兽医病理学家（K.S.）的监督下评估组织学。对于数字图像分析，使用软件QuPath [v0.5.1]。为量化CD3⁺和CD79a⁺细胞，绘制8–10个矩形（1.25 mm x 0.875 mm）覆盖囊虫周围区域，用于自动细胞计数，并使用QuPath软件自动计数阳性和阴性细胞。

Mouse microglia isolation, culture, and stimulation

断头新生小鼠（P1-P4），去除嗅球和小脑，以及脑膜和脉络丛。组织 dissociated 并通过100 μl细胞 strainer 过滤。细胞在4 °C下以1500 RPM离心5分钟。将细胞沉淀重悬于5 ml DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）高葡萄糖（Gibco, Cat. No. 11965092）（10% FCS、0.5% Ciprofloxacin）中，并铺在先前用5 ug/ml Poly-L-Lysine（Merck, Cat. No. P8920）包被过夜的T25培养瓶上。T25培养瓶在37 °C、5% CO₂加湿培养箱中孵育12天，并重复更换培养基。在进一步分析前48小时，向培养物中添加20ng/ml M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）（Pepro-Tech, Cat. No. 315-02）。培养物在0.05% Trypsin-EDTA中于37 °C trypsinized 15分钟，用培养基洗涤，刮取，并 seeded to 96-well flat-bottom plate（Thermo Fisher Scientific），密度为1 x 10⁵个细胞每孔。静置过夜后，用CVF（2.5 μg/ml）刺激细胞0 - 72小时，并 either 裂解用于qPCR（定量聚合酶链反应），或进行细胞内染色检测 cleaved Caspase 3（Bio-techne, R&D Systems, Cat. No. IC835G）和使用FLICA Caspase assays检测活性Caspase 8（Bio-Rad, Cat. No. ICT099）和9（Bio-Rad, Cat. No. ICT960）通过流式细胞术。

ELISA

根据制造商说明使用 commercially available ELISA kits。使用人TNFα ELISA（R&D Systems, Cat. No. DTA00D）和FasL（R&D Systems, Cat. No. DFL00B）评估来自健康个体CVF刺激的PBMC培养上清液和来自坦桑尼亚NCC患者和对照血浆样本中两种凋亡介质的水平。

Intracellular ROS detection

根据制造商说明使用细胞内荧光活性氧（ROS） assay（Cell Biolabs, Cat. No. STA-342）测量CVF刺激的PBMC内的细胞内ROS活性。简要来说，用人PBMC用CVF 2.5 μg/ml刺激。72小时后，细胞用PBS洗涤两次，并向孔中加入100 μl 1X细胞可渗透荧光探针二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA），并在37 °C、5% CO₂下孵育。45分钟后，细胞用PBS洗涤两次，并使用CLARIOstar Plus plate reader（BMG LABTECH）在480 nm/530 nm测量与细胞内ROS活性成比例的荧光强度。向细胞中添加100 μM和1000 μM H₂O₂作为阳性对照。

RNA extraction and qPCR

对于小胶质细胞RNA提取，用含有1% β-巯基乙醇的RLysis buffer处理细胞，并使用Extractme Total RNA Micro Spin kit（BLIRT, Cat. No. EM31.1-050）根据制造商信息提取RNA。使用SuperScript? IV VILO mix（ThermoFisher Scientific）将RNA逆转录为cDNA。在LightCycler 480（Roche）上使用ABsolute qPCR SYBR Green（Thermo Fisher Scientific）进行qRT-PCR。使用ΔΔCt计算相对基因表达和差异。用于qRT-PCR的寡核苷酸序列详见表2。

Mass spectrometry analysis of CVF

如先前所述进行猪带绦虫CVF的质谱分析。使用WormBase Parasite database for T. solium（Version: WS282, October 2022）分析检索到的数据，以鉴定CVF中与凋亡相关的分子。

Statistical analysis

对于统计分析，使用Prism software（Version 10.1.2）（GraphPad Software, LLC, San Diego, CA, USA）。对于两组之间的直接比较，采用Mann-Whitney检验。对于多于两组，采用Kruskal-Wallis检验 followed by Dunn’s多重比较检验和 two-way ANOVA检验 followed by Tukey’s多重比较检验（如果观察更多时间点）。P值<0.05被认为具有统计学显著性。

Results

The vesicular fluid from degenerated T. solium cyst (CVF) causes apoptosis but not necrosis in human T cells and monocytes

我们之前的发现表明，来自猪带绦虫囊虫的囊泡液（CVF）促进肺泡巨噬细胞凋亡。在此，我们扩展研究以评估CVF对各种外周免疫细胞群体的促凋亡作用。为评估CVF对PBMC的影响，我们通过Annexin V/PI染色分析了早期凋亡（Annexin V⁺/PI^-）和晚期凋亡（Annexin V⁺/PI⁺）细胞群体。我们的数据显示，CVF在PBMC中诱导显著凋亡。这种效应是浓度依赖性的，并且主要限于凋亡而非坏死，以剂量依赖性方式影响CD3⁺ T细胞和CD3^-细胞（非T细胞）。值得注意的是，CD3^-免疫细胞表现出比CD3⁺ T细胞更显著的凋亡反应。此外，凋亡效应随时间增强，特别是在晚期凋亡的CD3⁺和CD3^-细胞群体以及CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺ T细胞亚群中。有趣的是，虽然CD3^-和CD8⁺早期凋亡细胞随时间减少，但晚期凋亡群体增加，表明CVF暴露后从早期到晚期凋亡的动态进展。鉴于CD3^-细胞显著受到CVF诱导的凋亡影响，我们进一步研究单核细胞亚群以确定其易感性，因为单核细胞也是PBMC中仅次于淋巴细胞的第二大细胞群体。使用磁性激活细胞分选（MACS）从PBMC纯化单核细胞，并分类为经典（CD14⁺CD16^-）和非经典（CD14^dimCD16⁺）单核细胞。我们的发现证实了CVF的促凋亡潜力， demonstrating 在两种单核细胞亚群中随时间从早期到晚期凋亡的转变。值得注意的是，单核细胞对自发细胞凋亡非常敏感，尤其是在培养的前24小时。

总之，我们的发现表明，退化的猪带绦虫囊虫主动驱动凋亡，而非非凋亡性死亡（坏死），在外周免疫细胞群体中。这种效应在CD8⁺ T细胞和单核细胞中尤为明显。这些结果强调了退化囊虫衍生分子对免疫细胞的选择性靶向，进一步暗示它们在NCC相关系统性免疫炎症和失调中的作用。

Cyst degeneration drives T and B cell infiltration and microglia/macrophage activation in brains of naturally infected pigs

猪作为猪带绦虫囊虫的自然宿主，其感染在许多方面 mirror 人类NCC的免疫病理反应。为扩展我们对CVF诱导宿主免疫细胞凋亡的发现，我们检查了CVF对猪外周免疫细胞的影响，并通过分析自然感染猪脑中具有完整和退化猪带绦虫囊虫的肉芽肿中的免疫反应评估其与CNS的相关性。在与人类PBMC相同条件下处理猪PBMC with CVF，并在CD3⁺ T细胞（包括主要亚群（CD4⁺CD8α^-、CD4^-CD8α⁺、CD4⁺CD8α⁺）以及CD172a⁺