UV辐射通过激活糖基化通路促进血橙果皮花青素生物合成及其分子机制研究

本研究系统阐明了紫外线（UV）辐射通过激活糖基化修饰通路（UGTs）显著促进血橙（Citrus sinensis）果皮花青素生物合成与着色的分子机制，结合转录组（RNA-seq）、靶向代谢组（WGCNA）及基因共表达分析，发现UGT79B1、BZ1和GT1等关键糖基化酶基因是调控花青素多样性积累的核心靶点，为提升血橙商业价值提供了理论依据与技术途径。

　　

1 Introduction

血橙的商业价值与其果皮和果肉中红色色素的形成密切相关，这一过程主要由花青素的积累驱动。光作为花青素合成的关键环境因子，不同光谱尤其是紫外线（UV）辐射对果皮色素沉着的具体影响尚未完全阐明。在西南地区，血橙果实通常在2月至3月成熟，但留树越冬会增加冻害风险，因此果实通常在12月采收，限制了花青素积累，导致着色不良，显著影响其商业价值和市场竞争力。因此，寻找高效安全的方法促进血橙果皮花青素积累对提升商业价值具有重要意义。

花青素的生物合成是一个复杂且精确调控的代谢过程。该途径从苯丙氨酸开始，通过一系列酶促反应生成花青素苷元，再通过糖基化修饰形成稳定的花青素。这一过程涉及多个结构基因，包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、黄烷酮-3-羟化酶（F3H）、二氢黄酮醇-4-还原酶（DFR）和花青素合成酶（ANS）等。与许多次级代谢途径基因成簇排列不同，花青素生物合成的结构基因通常分散在基因组不同位置，表明其调控更为复杂，依赖多个协调因子。在转录水平上，这些结构基因的表达受到由R2R3-MYB、bHLH和WD40重复蛋白组成的转录复合体（MBW复合体）的严格调控。其中MYB转录因子通常是决定调控特异性的关键组件，能够识别并结合下游结构基因启动子中的特定顺式作用元件，从而激活转录。bHLH和WD40蛋白作为辅因子，通过与MYB蛋白相互作用增强转录激活复合体的稳定性和活性。除了核心正调控模块，植物还进化出负调控因子以实现花青素合成的精确时空控制。

花青素的生物合成受多种内源和外源信号调控，包括发育信号、植物激素和环境因子。在各种环境因子中，光是调控花青素合成的最关键因素之一。在光谱中，紫外线辐射，特别是UV-B（280–315 nm）和UV-A（315–400 nm），是诱导花青素积累的有效信号。UV-B主要由UVR8（UV抗性位点8）光受体感知，而UV-A主要由隐花色素（CRYs）感知。这些光信号通过下游信号元件如COP1和HY5传递。HY5作为bZIP转录因子，在光信号转导中起核心作用，能够直接结合花青素合成相关结构基因和调控基因（如CHS、DFR和MYB）的启动子，促进其表达。大量研究表明UV辐射是促进果皮着色的关键因子，但现有研究多关注光与无光（如套袋处理）的整体效应，很少区分可见光（VL）和紫外线在血橙果皮花青素合成中的独立作用。

为填补这一空白，本研究设计了三种光处理：完全遮光（CK）、可见光源（VL）和紫外光（UV），结合靶向代谢组学和转录组学分析技术，系统分析UV辐射对血橙果实发育期间果皮花青素生物合成的具体调控效应。研究结果将增进我们对环境因子调控柑橘果实品质的理解，并为通过优化光管理提高血橙营养价值和商业性状提供重要理论依据和技术参考。

2 Materials and methods

2.1 Experimental materials and design

研究选用重庆市农业科学院果树研究所镇武柑橘基地的七年生‘Tarocco’血橙树。选择三十棵均匀树木，十棵作为CK，十棵接受VL照射，十棵接受UV照射。在果皮着色期，使用遮阳网阻挡外部光线。随后，果面分别暴露于VL（白光400–700 nm）或UV光（UV-A 315–400 nm和UV-B 280–315 nm），光强设置为540 μmol/m²/s。VL和UV处理的植株保持16小时光照和8小时黑暗的光周期，未暴露的果实作为CK。处理开始后每20天取样一次，每次处理随机选取树冠外围五个果实，三个重复。取样后，果皮外层剥离并液氮冷冻保存于-80°C。

2.2 Determination of the appearance color of fruit peel

使用色差计CR-400光谱光度计测定果皮三个不同点的CIE L、a和b^*值，颜色指数（CI）计算公式为：CI = 1000 × a / (L × b)。

2.3 Determination of the anthocyanin content in fruit peel

采用分光光度法测定果皮花青素含量，计算公式为：花青素含量（g kg^-1 FW）= (A₅₁₀ at pH 1.0 – A₅₁₀ at pH 4.5) × 484.8（花青素分子量）/ 24,825（花青素在A₅₁₀的摩尔吸光系数）×稀释倍数。

2.4 Anthocyanin-targeted metabolome analysis

在武汉MetWare生物技术公司进行靶向代谢组学分析，数据可靠性通过质量控制（QC）评估，使用Analyst软件（版本1.6.1）进行统计分析和热图生成。

2.5 Illumina transcriptomic sequencing

使用TRIzol试剂提取总RNA，通过Agilent 2100 Bioanalyzer系统和1%琼脂糖凝胶评估RNA完整性和污染。测序文库构建包括mRNA纯化、片段化、cDNA合成和末端修复，然后在HiSeq 2500系统上进行测序。使用FeatureCounts计算FPKM值，DESeq2进行差异表达分析，基因表达差异显著性阈值设定为|log2Fold Change|≥1且FDR<0.05。

2.6 Application of WGCNA in metabolite and transcriptome analysis

使用R包WGCNA构建基因共表达网络模块，并分析这些模块与花青素代谢物丰度的关联。模块基于拓扑重叠度量（TOM）构建，通过特征基因值识别与花青素相关代谢物的关联。

2.7 RNA?seq data validation by qRT-PCR

使用SYBR Green系统进行qRT-PCR验证，循环条件为95°C预变性5分钟，94°C 30秒，56°C 30秒，72°C 90秒，共35个循环。引物使用Primer Premier 5.0软件设计，相对基因表达水平通过2^?ΔΔCt方法计算，所有程序包括三个独立技术和生物学重复。

3 Results

3.1 Effects of UV light on fruit peel color and anthocyanin accumulation in blood oranges

光处理20天后，各处理间果实表型和颜色指数（CI）无显著差异。但40天后，UV处理的果皮颜色显著变化，CI显著高于VL和CK处理。相应地，UV处理果皮的花青素含量也显著高于VL和CK。回归分析显示果皮CI与花青素含量呈显著正相关，表明UV处理促进血橙果皮着色和花青素积累。

3.2 Sequencing data statistics

RNA测序产生1,692,161,564条清洁读数，平均每个样本47,004,487条读数。相关性分析显示各处理时间点的生物学重复样本间强相关，平均Q30值为95.16%，确认测序数据高质量。

3.3 Transcriptomic analysis of fruit peel under different treatment

PCA分析中PC1和PC2分别占总变异的16.99%和14.7%，表明转录组数据具有较强的区分力。层次聚类热图显示不同的时间基因表达模式，UV处理样本在某些时间点与CK和VL处理呈现相反趋势。共鉴定5,470个差异表达基因（DEGs），VL处理在20天、40天和60天分别检测到1,501、1,901和1,197个DEGs，UV处理则分别有1,250、1,112和1,686个DEGs。VL和UV处理间共鉴定1,362个DEGs，其中152个为共表达基因。

3.4 Clustering and functional analysis of separate developmental periods

通过k-means聚类将DEGs分为8个亚组，其中5个亚组在不同时间点呈现相反趋势。KEGG功能富集分析显示亚组3、4和7的DEGs主要参与代谢途径、黄酮和黄酮醇生物合成以及花青素合成，亚组5和8则富集于植物次生代谢物相关途径。值得注意的是，主要富集于花青素合成的亚组7在UV处理0-20天下调，但在40-60天上调，与观察到的花青素积累趋势一致。

3.5 Targeted metabolism analysis of anthocyanins in fruit peel

通过包含83种花青素代谢相关化合物的靶向数据库，获得不同处理血橙果皮的花青素代谢组数据。PCA分析显示各采样时间点的UV处理样本良好分离，而VL和CK样本聚类在一起，可能由于其代谢物水平较低。所有样本和靶向代谢物的聚类分析确认UV处理40天后形成独立组别，其他两种处理归为另一类别，与花青素含量结果一致。筛选含量高于1μg g^-1的花青素相关代谢物，结果显示仅UV处理60天样本中鉴定出10种花青素化合物，且UV处理中花青素化合物数量远高于其他处理。所有样本中槲皮素-3-O-葡萄糖苷含量最高，其次是花翠素-3-O-(6-O-丙二酰-β-D-葡萄糖苷)、花翠素-3-O-槐糖苷、花翠素-3-丙二酰-葡萄糖基-葡萄糖苷和花翠素-3-O-葡萄糖苷。虽然槲皮素及其糖苷广泛存在并作为重要抗氧化剂和次生代谢物，它们不直接贡献血橙着色，而花青素糖苷衍生物是主要着色化合物。

3.6 Profiling the expression of transcription factors implicated in anthocyanin biosynthesis pathways

共检测1,513个表达丰度不同的转录因子（TFs），其中122个与花青素代谢相关，分属40个家族。最多的是NAC（11）、AP2/ERF-ERF（9）、MYB（9）和bHLH（9）。UV处理40天和60天样本的TF表达水平显著高于其他处理。

3.7 Co-expression network analysis of weighted genes

通过WGCNA分析，将基因分类为21个颜色编码模块，每个模块表示基因间显著相关性。根据靶向代谢组学分析结果，选择花青素代谢物进行ANOVA分析，若处理间存在显著差异则用于后续WGCNA分析。Pearson相关性分析鉴定出三个模块（lightgreen、magenta和royalblue）与花青素代谢化合物（花翠素-3-O-(6-O-丙二酰-β-D-葡萄糖苷)、花翠素-3-O-葡萄糖苷、花翠素-3-丙二酰-葡萄糖基-葡萄糖苷、花翠素-3-O-槐糖苷和槲皮素-3-O-葡萄糖苷）显著相关。UV处理上调了所有模块中的大多数基因。KEGG富集分析显示这些模块中的特征基因主要参与氨基酸代谢、次生代谢物合成和碳水化合物代谢途径，同时还富集了与光合作用、植物激素信号转导、类黄酮生物合成和植物昼夜节律相关的基因。

为识别关键调控因子，选择每个模块的前10个枢纽基因建立相对相关性网络。在这些模块中，鉴定出三个基因：lightgreen模块中的花青素3-O-葡萄糖苷2’’’-O-木糖基转移酶（UGT79B1, Cs_ont_4g013850）、magenta模块中的花青素3-O-葡萄糖基转移酶（BZ1, Cs_ont_5g016710）和royalblue模块中的花青素5,3-O-葡萄糖基转移酶（GT1, Cs_ont_9g026870），表明这些基因在血橙果皮着色过程中的花青素代谢中起重要作用。

3.8 qRT-PCR validation

通过qPCR验证随机选择的10个DEGs，相对表达水平（2^?ΔΔCt）与转录组数据（FPKM）高度一致，存在显著正相关（R2 = 0.9317），确认RNA测序数据高度可靠。

4 Discussion

果皮颜色是决定血橙商业价值和消费者偏好的关键因素。血橙独特的红色主要源于花青素的积累。本研究发现与VL和CK相比，UV光照显著促进果皮着色和花青素积累，果皮颜色指数（CI）与花青素含量呈强正相关。这些结果与先前在不同植物物种中的发现一致，如蓝莓、葡萄、芒果和生菜，UV辐射有效促进花青素合成。植物响应UV胁迫的花青素积累是一种重要保护机制。花青素和其他类黄酮能吸收高能UV波段（280–315 nm）辐射，保护敏感细胞内组件如叶绿体和DNA免受损伤。此外，UV胁迫诱导活性氧（ROS）产生，花青素作为有效抗氧化剂，能消除过量ROS并减轻氧化损伤。本研究中UV处理40天后花青素含量显著增加，但20天时未增加，表明UV诱导的花青素积累是一个渐进和累积过程，需要持续刺激。

本研究鉴定的主要显色花青素——花翠素-3-O-葡萄糖苷、花翠素-3-O-槐糖苷和花翠素-3-O-(6-O-丙二酰-β-D-葡萄糖苷)——与先前在各种红色或紫色植物组织中的发现一致。例如，在甜樱桃、桑葚、黑刺李和一些有色谷物中，花翠素-3-O-葡萄糖苷或其芦丁糖苷被证明是主要着色花青素。因此，我们的研究将血橙着色机制与植物色素更广泛的生化背景联系起来，确认血橙遵循植物界保守的着色策略。进一步，本研究检测到的丙二酰化花青素——花翠素-3-O-(6-O-丙二酰-β-D-葡萄糖苷)——表明血橙果皮不仅合成基础花青素，还通过后续酶促反应精炼其结构，实现更持久和强烈的颜色呈现。

一个重要发现是“花青素相关代谢物”中含量最高的实际上是槲皮素-3-O-葡萄糖苷，这是一种黄酮醇而非花青素。黄酮醇通常无色或淡黄色，不直接贡献红色着色，但其高丰度表明在果皮生理中起关键非显色作用。首先，黄酮醇是高效UV-B吸收剂，在植物光保护中起核心作用。UV-B辐射暴露可诱导植物产生大量ROS，黄酮醇不仅能通过吸收UV-B辐射减少ROS渗透到敏感靶细胞内部，还能直接消除ROS以减轻氧化损伤。其次，黄酮醇作为辅色素，能通过疏水相互作用和氢键与花青素分子形成复合物，增强花青素颜色强度（增色效应）并将其颜色从红色变为紫色或蓝色（红移效应），同时提高花青素在水溶液中的稳定性。因此，血橙果皮中高水平的槲皮素-3-O-葡萄糖苷可能与花青素相互作用，塑造血橙果皮独特、稳定和饱和的红色着色。

本研究中，我们通过WGCNA将复杂DEGs数据集简化为21个功能模块，并成功鉴定出与花青素代谢物含量变化最相关的三个模块。这不仅显著缩小了候选基因池，还揭示了这些基因间的内在功能联系，与最近其他柑橘类水果的发现一致。关键模块的KEGG富集揭示了花青素合成与更广泛代谢途径间的强联系，包括氨基酸代谢、次生代谢物合成和碳水化合物代谢。苯丙氨酸作为苯丙烷途径的起始底物，直接影响整个类黄酮途径包括花青素的生物合成通量。碳水化合物代谢不仅为合成过程提供能量（ATP）和还原力（NADPH），更重要的是提供花青素糖基化修饰所需的糖供体（如UDP葡萄糖）。这些结果表明血橙果皮中高效的花青素积累受到初级和次级代谢的协同调控。通过这种精确整合的网络调控，细胞确保合成前体、能量和修饰基团的充足供应。这种代谢流的整合与调控在植物色素形成和胁迫响应中常见。

除了关键糖基转移酶基因的鉴定，我们的结果还强调了转录因子（TFs）在塑造花青素生物合成和果皮着色中的调控作用。特别是MYB、bHLH和WD40家族成员在UV处理下显著上调，这与它们在形成MBW转录复合体直接激活CHS、DFR和ANS等结构基因的作用一致。这一调控复合体活性的增强导致花青素基花青素产量增加，包括花翠素-3-O-葡萄糖苷及其丙二酰化衍生物，这些是贡献血橙果皮红色的主要色素。因此，我们研究中的调控框架可概念化为“转录因子–基因–代谢物–颜色”轴。沿此轴，TFs（如MYB、bHLH和WD40）调控结构基因表达，决定花青素代谢物的合成和积累。这些代谢物的定性和定量组成直接转化为观察到的果皮颜色。

本研究的一个关键成果是鉴定三个糖基转移酶（UGTs）基因作为关键模块中的枢纽基因。沿花青素合成途径，糖基化是最终关键修饰步骤，通过附加糖基（如葡萄糖、半乳糖、木糖等）到花青素上，决定其稳定性、溶解度、色调和生物活性。本研究鉴定的BZ1（花青素3-O-葡萄糖基转移酶）和GT1（花青素5,3-O-葡萄糖基转移酶）催化C3和C5位置的糖基化，形成稳定的花青素结构。UGT79B1（3-O-葡萄糖苷2’’’-O-木糖基转移酶）的鉴定进一步揭示了血橙中复杂的糖基化修饰，添加木糖到葡萄糖上形成更多样化的多糖链。这种修饰是植物中物种特异性花青素谱形成的关键。先前对血橙果肉的研究多关注花青素合成途径上游结构基因（如CHS、DFR、ANS）及其调控转录因子（如MYB、bHLH、WD40复合体）。本研究通过WGCNA鉴定这些UGTs基因为网络中的“枢纽”，表明在血橙果皮中，下游糖基化修饰步骤是花青素最终积累和品种多样性的核心调控节点。这为花青素合成的精细调控提供了新视角，即一旦转录因子启动合成途径，UGTs基因的差异表达决定终产物的结构和多样性。

5 Conclusions

本研究证明UV光显著促进血橙花青素积累和增强果皮着色。鉴定出花翠素-3-O-葡萄糖苷、花翠素-3-O-槐糖苷、花翠素-3-丙二酰-葡萄糖基-葡萄糖苷和花翠素-3-O-(6-O-丙二酰-β-D-葡萄糖苷)等关键花青素代谢物作为与花青素生物合成和果皮着色直接相关的主要化合物。转录组分析揭示了UV处理下基因表达模式的显著差异，特别是类黄酮生物合成途径中的基因。网络分析鉴定出三个糖基转移酶（UGT）基因——UGT79B1、BZ1和GT1——作为通过复杂糖基化修饰调控花青素多样性和积累的关键调控因子。重要的是，与果肉不同，果皮中的花青素生物合成涉及通过糖基化修饰进行精细调控的额外维度。这些发现为制定利用靶向UV处理提高血橙市场价值的栽培策略提供了宝贵见解。