胸膜肺炎放线杆菌铁饥饿应答的转录组与蛋白质组整合分析揭示其铁获取与代谢重编程机制

本研究通过整合转录组和蛋白质组分析，系统性揭示了胸膜肺炎放线杆菌（APP）在铁饥饿条件下的适应性调控机制。研究发现APP通过显著下调能量代谢和细胞呼吸相关通路以节约铁资源，同时上调TonB-ExbB-ExbD能量转导系统及多种铁载体受体（如TbpA/B、HgbA）的表达以增强铁获取能力。该研究为开发针对APP的新型疫苗（如靶向铁调控外膜蛋白）提供了重要理论依据和潜在靶点。

　　

1 引言

胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）是猪传染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia, PCP）的主要病原体，对全球养猪业构成严重威胁。该病原体包含2种生物型和19种血清型，且不同血清型间交叉免疫保护较弱，使得现有疫苗防控效果有限。铁是细菌生长和致病性的关键元素，参与呼吸作用、ATP生成及DNA复制修复等核心生理过程。宿主通过铁结合蛋白（如转铁蛋白和乳铁蛋白）实施营养免疫，限制游离铁的可利用性，从而迫使APP进化出高效的铁获取系统以维持生存和致病力。此前研究虽对APP在铁限制条件下的转录响应有所报道，但缺乏蛋白质水平的验证及多组学整合分析。

2 材料与方法

研究采用APP血清1型参考菌株4074，通过在培养基中添加20 μM去铁胺（DFO）模拟铁限制条件，以常规TSB+NAD培养基作为对照。分别提取对照组和铁限制组的RNA和蛋白质，采用Illumina NovaSeq X Plus平台进行转录组测序（RNA-seq），利用Orbitrap Astral质谱仪进行蛋白质组数据非依赖采集（DIA）。差异表达基因（DEGs）和差异表达蛋白（DEPs）的筛选标准分别为|log2FC|≥1且FDR<0.05，以及FC>1.2或<0.83且P<0.05。通过GO和KEGG数据库进行功能注释和富集分析，利用STRING构建蛋白质互作网络，并通过qRT-PCR对关键基因表达进行验证。

3 结果与讨论

3.1 转录组与蛋白质组差异表达分析

PCA分析显示铁限制组与对照组在转录和蛋白水平上显著分离。共鉴定到458个DEGs（181上调，277下调）和532个DEPs（263上调，269下调）。整合分析发现137个基因在转录和蛋白水平共同差异表达，其中40个基因上调、97个下调，且多数表达趋势一致。功能富集显示下调基因主要集中于前体代谢物和能量生成、离子结合及金属簇结合等通路，而上调基因显著富集于铁运输与铁结合过程。

3.2 铁饥饿下的代谢抑制与能量节约机制

铁饥饿条件下，APP显著抑制了依赖铁的代谢通路。厌氧呼吸链相关基因（如dms、frd、nap、tor和nrf操纵子）及氢酶系统（hyp、hya/hyb）均显著下调，以减少对铁硫簇和血红素辅因子的消耗。氨基酸代谢（sda、lld）、糖原合成（glg）及氮代谢相关基因也普遍下调，体现了APP在铁匮乏时优先维持核心代谢、抑制非必需途径的适应性策略。此外，铁存储蛋白FtpA及多种核糖体蛋白（如L33、S20等）的表达下降，进一步证实了铁节约响应。

3.3 铁获取系统的协同激活

为应对铁饥饿，APP显著上调了多种铁获取系统：

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  TonB-ExbBD能量转导系统：TonB1-ExbB1-ExbD1系统表达大幅上调（转录6.25倍，蛋白21.59倍），TonB2系统上调幅度较小（转录2.16倍，蛋白1.93倍），表明TonB1是主要的能量供应系统。
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  宿主源铁利用系统：转铁蛋白受体tbpA/tbpB（蛋白上调11.42/9.13倍）和血红蛋白受体hgbA及其利用蛋白hutZ（蛋白上调13.75/11.41倍）均显著诱导。一个未知功能的TonB依赖受体APPSER1_07080（推测为血红素受体）表达急剧升高（蛋白24.77倍），可能识别新型铁载体。
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  铁载体介导的铁获取：铁载体介导的铁获取：儿茶酚盐铁载体利用系统fec样操纵子（APPSER1_03805–03820）显著上调，而铁色素受体fhuA未发生显著变化，印证其不受铁调控的特性。
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  应激防御与金属稳态：Fe-S簇组装蛋白NfuA、锰转运系统sit、低pH Fe²⁺摄取系统efe及外排泵（如CopA、AcrAB、Sap系统）均显著上调，以缓解铁饥饿引发的氧化应激及金属毒性。
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  其他关键基因：GntP家族渗透酶（APPSER1_00740，蛋白23.9倍）和甘油酸激酶（APPSER1_00745，蛋白20.2倍）可能通过糖代谢途径辅助铁获取；核糖体结合ATP酶RbbA（APPSER1_04465）蛋白表达上调693.5倍，可能通过促进翻译效率支持应激响应。

3.4 转录调控与潜在疫苗靶点探索

全局调控因子HlyX（FNR）显著上调，可能协同抑制耗铁代谢并促进铁获取基因表达；而Fur蛋白表达无显著变化，表明铁饥饿主要通过解除Fur抑制而非增加其丰度来调控靶基因。通过多组学数据筛选出多个在铁限制下显著表达的外膜蛋白、脂蛋白及Apx毒素，如功能未知的TonB依赖受体APPSER1_07080和APPSER1_10885，这些蛋白可作为潜在疫苗靶点进行后续评估。

4 结论

本研究通过整合转录组与蛋白质组分析，揭示了APP响应铁饥饿的双重策略：一方面通过抑制厌氧呼吸、能量代谢及核糖体合成等耗铁过程节约资源；另一方面激活TonB系统、宿主源铁利用系统、儿茶酚盐铁载体获取及应激防御通路以增强铁摄取能力。这些发现不仅深化了对APP铁适应机制的理解，也为开发靶向铁调控蛋白的新型疫苗提供了重要候选分子。