Piezo1通过Ca2+非依赖机制抑制破骨细胞生成：炎症性骨丢失的新治疗靶点

本研究发现Piezo1作为破骨前体细胞（pre-OCs）的关键机械感受器，通过独特的Ca2+非依赖机制激活PP2A（蛋白磷酸酶2A），使Akt去磷酸化，进而抑制NFATc1（活化T细胞核因子胞质1）驱动的破骨细胞生成（OC-genesis）。在牙周炎等炎症性骨丢失疾病中，机械应力降低导致Piezo1功能受损，而药理激动剂Yoda1可恢复其抗骨吸收功能，为治疗炎症性骨病提供了新策略。

　　

引言

骨骼完整性依赖于机械刺激，其在废用性骨质疏松或牙周炎等疾病中的缺失会增强破骨细胞（OCs）介导的骨吸收。尽管Piezo1是多种细胞中特征明确的机械敏感性离子通道，但其在破骨细胞谱系细胞中的功能尚不清楚。

方法

研究采用小鼠牙周骨丢失模型和体外分化实验检测破骨前体细胞（pre-OCs）中Piezo1的表达和信号传导。应用遗传学和药理学方法操纵Piezo1活性，重点评估NFATc1调控、Akt磷酸化和PP2A活性等下游通路。在炎症性骨丢失模型中测试了Piezo1激动剂Yoda1的治疗潜力。

结果

Piezo1在pre-OCs中选择性表达并发挥功能，作为机械传感器抑制RANKL（核因子κB受体活化因子配体）诱导的破骨细胞生成。Piezo1的激活通过Ca²⁺非依赖机制（涉及PP2A介导的Akt去磷酸化）抑制NFATc1，这与经典的Ca²⁺-calcineurin（钙调神经磷酸酶）通路不同。在健康牙周骨中，Piezo1在机械负荷下抑制破骨细胞分化，保持骨量。牙周炎期间，机械力减少损害了Piezo1功能，导致破骨细胞激活失控和病理性骨吸收。用Yoda1药理激活Piezo1可恢复抗骨吸收通路，有效防止炎症性骨丢失，即使在缺乏机械输入的情况下也是如此。

讨论

研究结果重新定义了Piezo1作为pre-OCs中的关键机械传感器，并确立了Piezo1-PP2A-Akt轴作为NFATc1驱动破骨细胞生成的新型调节器。这些发现为机械受损状态下的骨吸收提供了机制解释，并突出了Piezo1激活作为模拟机械线索、抑制牙周炎、类风湿性关节炎和骨质疏松等疾病中病理性破骨细胞生成的潜在治疗策略。

1 引言

牙周炎的发病和进展源于宿主对牙周微生物群中机会性病原体的免疫反应过度激活，进而导致牙周组织（包括牙槽骨）的破坏性炎症。牙周炎症引发血管生成、血管扩张和血管通透性增加，促进免疫细胞（包括单核细胞和巨噬细胞）响应T淋巴细胞而迁移增强。破骨细胞（OCs）作为单核细胞系细胞，在炎症性骨溶解疾病（如类风湿性关节炎和牙周炎）的骨吸收中起关键作用。破骨前体细胞（pre-OCs）是抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）⁺单核单核细胞系细胞，通过激活主转录因子（TF）NFATc1（活化T细胞核因子胞质1）以RANKL依赖方式融合形成多核成熟TRAP⁺破骨细胞。RANKL介导的破骨细胞生成需要来自免疫受体酪氨酸-based激活基序（ITAM）受体（如OSCAR和TREM2）的许可共刺激信号，通过Ca²⁺振荡引发calcineurin/calmodulin信号轴，进而上调NFATc1表达。

循环中的单核细胞是pre-OCs的重要来源，它们粘附于毛细血管内皮并迁移至稳态骨重塑部位以及骨溶解病变处，响应脂质介质和特定趋化因子（如S1P、MCP-1、CXCL12、SDF-1、CX3CL1或MIF）的信号。内皮细胞（ECs）中表达的细胞间粘附分子1（ICAM-1）是一种细胞表面糖蛋白，调节牙周炎症期间pre-OCs的迁移。血流作为机械力作用于血细胞（如T淋巴细胞、血小板以及pre-OCs）。尽管牙周炎中的慢性炎症会导致毛细血管直径扩张，但牙周炎病变血管中的血流速度显著降低。有报道称，健康牙龈组织中的血流速率在老年组显著低于年轻组。基于这些证据，可以推测牙周炎影响的牙周组织中的造血细胞（包括pre-OCs）所受机械应力较健康牙周组织减少。增加的机械刺激可改变牙周组织中细胞（包括牙周韧带细胞和成骨细胞）的各种活性，但机械应力减少（尤其是牙槽骨）的结果在牙周炎背景下大多未知。

因此，为阐明这些未解问题，研究转向机械感觉系统，其重要性因2021年诺贝尔奖授予机械敏感Piezo Ca²⁺通道的发现而凸显。具体而言，机械刺激下，Piezo1通道通过重排锚定在其近端的细胞骨架肌动蛋白而打开，从而引发Ca²⁺内流，诱导多种活性的细胞信号传导。尽管破骨细胞谱系细胞中Piezo1条件性敲除的小鼠模型未显示骨表型，但体外结果确实表明剪切应力可抑制破骨细胞生成。因此，研究假设破骨细胞谱系细胞表达的Piezo1与致病性骨表型相关。本文报道Piezo1是pre-OCs上表达的主要机械感觉受体，对pre-OCs的机械应力减少可能阻碍Piezo1介导的破骨细胞生成下调，而不影响局部炎症介质的强度。研究进一步发现，pre-OCs上Piezo1的激活引发了一种独特的细胞信号轴，涉及PP2A介导的Akt去磷酸化，进而抑制破骨细胞生成的主转录因子NFATc1的表达。

2 材料与方法

2.1 动物

为生成Piezo1^fl/fl LysM-Cre（Piezo1^ΔLysM）小鼠，将Piezo1^fl/fl小鼠与LysM-Cre小鼠杂交。使用Piezo1^fl/fl同窝仔作为对照。基因型通过尾DNA PCR确认。野生型C57BL/6J小鼠用于无需遗传操作的实验。使用6至8周龄雄性小鼠。实验程序经NSU IACUC批准（协议号TK7）。

2.2 细胞培养

从小鼠胫骨和股骨收集骨髓源性单核细胞（BMMCs），用含10%胎牛血清（FBS）、链霉素（100 μg/mL）、青霉素（100 U/mL）、两性霉素B（0.25 μg/mL）、L-谷氨酰胺（292 μg/mL）和M-CSF（25 ng/mL）的MEM-α培养基在37°C、5% CO₂湿润空气中培养3天获得pre-OCs。随后，用RANKL（10 ng/mL）将pre-OCs分化为破骨细胞。人外周血单核细胞（PBMCs）购自STEMCELL Technologies。PBMCs用M-CSF（30 ng/mL）在37°C、5% CO₂湿润空气中刺激3天。人pre-OCs用RANKL（100 ng/mL）分化为破骨细胞。使用Yoda1、GsMTx4、LY294002、FK506、Okadaic acid和DT-061以验证浓度处理。DMSO作为载体对照。

2.3 流动或静水压力下的细胞培养

剪切应力通过摇床或ibidi泵系统产生。pre-OCs接种于24孔板（1x10⁶细胞/孔），通过摇动（15°, 30 rpm）刺激剪切应力。对于ibidi泵系统，pre-OCs培养于μ-Slide I 0.4 Luer（3x10⁵细胞/孔），在5 dyn/cm²或20 dyn/cm²剪切应力下培养。对于静水压力（HP）加载，将培养皿置于烧杯底部，添加培养基至5.5 cm高度产生一致HP。对照细胞在1.2 cm培养基高度下于大气压下培养。

2.4 抗酒石酸酸性磷酸酶染色

使用TRAP染色试剂盒进行TRAP染色。简要而言，破骨细胞用柠檬酸盐/丙酮溶液固定30秒，用含L(+)-酒石酸盐缓冲液、乙酸缓冲液、Naphthol AS-BI磷酸和Fast Garnet GBC碱基的TRAP染色溶液在37°C黑暗环境中染色10分钟。具有≥3个核的TRAP阳性细胞被确定为多核破骨细胞。

2.5 陷窝形成 assay

根据先前报道制备磷酸钙涂层板。简要而言，将0.12 M Na₂HPO₄和0.2 M CaCl₂（50 mM Tris-HCl, pH 7.4）在37°C混合。磷酸钙浆液用无菌水洗涤后应用于培养板孔中，37°C过夜干燥。随后将BMMCs接种于磷酸钙涂层板孔中，处理6天后，用10%次氯酸钠洗涤10分钟并过夜干燥。陷窝区域通过显微镜成像，使用ImageJ软件分析。

2.6 细胞内Ca²⁺浓度测量

细胞（4x10⁴细胞/孔）接种于黑色壁/透明底板孔。使用Fluo-8 No Wash Calcium Assay Kit测量Ca²⁺内流。简要而言，添加Fluo-8 NW和0.04% Pluronic? F-127于HHBS缓冲液中，37°C孵育30分钟，随后室温30分钟。Yoda1处理后，每10秒测量490 nm激发、525 nm发射的荧光。使用BioFlux One系统或ibidi泵系统在流动条件下分析Ca²⁺内流。

2.7 siRNA转染敲低Piezo1

BMMCs接种于96孔板（3×10⁵细胞/孔）或24孔板（1×10⁶细胞/孔）。24小时后，BMMCs维持于Opti-MEM? Reduced Serum Medium，用50 nM Piezo1特异性siRNA（siPiezo1）、PP2A特异性siRNA（siPP2A）、PP2B特异性siRNA（siPP2B）或阴性对照siRNA（siCTL）转染，使用Lipofectamine? RNAiMAX Transfection Reagent按说明书操作。转染48小时后，BMMCs用于指示实验。

2.8 定量聚合酶链反应

使用PureLink RNA Mini Kit从pre-OCs提取总RNA。用Verso cDNA Synthesis Kit从100 ng样本RNA合成第一链cDNA。使用Taqman Fast Advanced Master Mix或SYBR Green Master Mix进行扩增反应。所得cDNA用特异性探针扩增Gapdh、Piezo1、Piezo2、Trpa1、Trpv4、Stoml3、Kcnk10、Kcnk4、Kcnk1、Ocstamp、Mmp9、Ctsk、Acp5、Oscar、Nfatc1、Tnfsf11和Tnfsf11b。mRNA水平与对照基因的比率使用ΔCt方法（2^?ΔΔCt）计算。

2.9 PCR array

从细胞提取总RNA并合成cDNA后，使用Taqman Fast Advanced Master Mix和TaqMan? Array Mouse Osteogenesis测试所得cDNA。使用集成基于网络的数据分析软件包进行数据分析。

2.10 磷酸化抗体 array

使用Phospho Explorer Antibody Array分析磷酸化蛋白水平。简要而言，收集BMMCs细胞裂解物并用BCA Protein Assay Kit定量。微阵列载玻片封闭，蛋白质用生物素标记后耦合至载玻片。洗涤载玻片，添加Cy3-链霉亲和素结合生物素。荧光强度测量并由制造商分析。使用KEGG和IPA评估靶蛋白和信号通路的聚类。

2.11 Western blotting

培养不同时间后，pre-OCs用含蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液冰上孵育30分钟裂解。所得裂解物蛋白质浓度用BCA Protein Assay Kit测量。每孔15 μg样本上样于4–12% SDS-PAGE凝胶。SDS-PAGE凝胶中分离的蛋白质电转移至PVDF膜。使用抗磷酸化Akt兔单抗、抗Akt兔单抗、抗磷酸化p38 MAPKs兔单抗、抗p38 MAPKs兔单抗、抗磷酸化ERK兔单抗、抗ERK兔单抗、抗磷酸化JNK兔单抗、抗JNK兔单抗、抗IkBa兔单抗、抗磷酸化PP2A小鼠单抗、抗PP2A小鼠单抗或抗GAPDH兔单抗检测pre-OCs中特定蛋白质。与各自抗体反应的蛋白质条带通过HRP偶联兔或小鼠二抗孵育，随后使用ECL Western Blotting Substrate检测。使用ImageJ软件进行光密度分析。

2.12 共免疫沉淀 assay

为检查RANK与TRAF6或Piezo1与PP2A的相互作用，进行Co-IP。pre-OCs用冰冷RIPA缓冲液裂解。裂解物离心澄清后与抗RANK抗体或抗Piezo1抗体4°C过夜孵育。免疫复合物用Protein A/G磁珠捕获1小时。珠粒用TBST洗涤三次，结合蛋白质在LDS样本缓冲液中洗脱，随后用抗TRAF6抗体或抗PP2A抗体进行免疫印迹。

2.13 免疫荧光

培养于Millicell EZ SLIDE的pre-OCs用4%多聚甲醛室温固定10分钟，2% Triton X-100透化，5% BSA in PBS封闭1小时。细胞与Alexa Fluor? 594偶联抗Piezo1抗体、Alexa 594偶联同型对照抗体、抗NFATc1抗体或同型对照抗体4°C过夜孵育。应用Cy3偶联山羊抗小鼠IgG二抗1小时，随后用CellMask? Green Actin Tracking Stain和含DAPI的Fluoromount-G。免疫荧光用Zeiss LSM880共聚焦显微镜成像。

2.14 牙周疾病小鼠模型

为诱导小鼠牙周疾病，将5–0丝线结扎于上颌第二磨牙。Yoda1（0.4 mg/kg）、DT-061（0.4 mg/kg）或DMSO（0.86%）稀释于PBS with 5%乙醇，通过腹腔途径每2天注射（第0、2、4和6天）。7天后，处死小鼠进行尸检分析。

2.15 监测血液灌注单位（BPU）

通过激光多普勒血流仪实时监测BPU。将细针型血流探头附着于腭龈近中或远中表面。实时数据通过Labchart 8软件捕获和分析。

2.16 组织学分析

小鼠上颌骨在4%多聚甲醛中4°C固定过夜，在10% EDTA中4°C脱钙2周。组织包埋于OCT化合物中-20°C过夜，用冷冻切片机切成8 μm切片。脱钙牙周组织TRAP染色使用Acid Phosphatase Leukocyte (TRAP) Kit进行，随后用甲基绿核复染。切片用EVOS XL Core显微镜成像。为免疫荧光检测OC-STAMP和磷酸化Akt，切片与抗OC-STAMP兔多抗或抗磷酸化Akt兔单抗作为一抗4°C过夜反应。使用Cy3偶联抗兔IgG FC山羊多抗作为二抗。染色切片用含DAPI的Fluoromount-G封片。免疫荧光用Zeiss LSM880共聚焦显微镜观察。

2.17 Micro-CT分析

小鼠上颌牙槽骨在4%磷酸缓冲多聚甲醛中4°C固定16小时。Micro-CT图像使用Microfocus X-ray CT扫描系统获取，设置如下：加速电压50 kV，电流500 μA，体素大小18 μm/像素，矩阵大小2000 × 1336。图像用NRecon软件重建，获取结扎侧和对照未处理侧图像。作为感兴趣区域（ROI），评估从上颌第一磨牙与上颌第二磨牙接触点冠状面的50张切片图像。使用CTAn软件测量整个腭侧牙槽骨（包括同侧硬腭）的骨体积（BV）。三维图像使用CTVox软件获取。为评估牙周骨吸收，测量上颌第二磨牙腭侧根从牙骨质-釉质交界处到牙槽骨嵴的距离。

2.18 统计分析

使用单因素ANOVA和Tukey’s HSD检验比较多组间差异，Student’s t检验比较两组间差异。所有统计分析使用GraphPad Prism进行。统计显著性设定为p < 0.05。所有数据表示为均值±SD。

3 结果

3.1 小鼠牙周炎中血流减少

尽管人牙周炎病变血管中血流速率显著降低，但小鼠诱导牙周炎中的血流是否减少未知。因此，为诱导小鼠牙周炎，将丝线结扎于上颌第二磨牙7天。为评估牙周炎对局部血流的影响，使用激光多普勒血流仪测量牙龈组织的BPU。不论牙周组织是否诱导炎症，牙周疾病组织中的BPU较健康组织显著降低。由于间质压力通常与局部血流速率成正比，推测牙周组织固有层细胞的机械应力也减少。

3.2 机械应力抑制RANKL诱导的破骨细胞生成（体外）

健康牙周组织微毛细血管中的血流速率约为20 dyn/cm²，而疾病牙周组织中降至约5 dyn/cm²。为比较流动速率影响，使用微流体系统评估流体剪切应力对RANKL诱导破骨细胞生成的影响。高流动速率（20 dyn/cm²）较