ZAP70缺陷的干细胞移植临床特征与疗效：单中心13例病例分析揭示免疫重建新策略

《Frontiers in Immunology》：Clinical, immunological, molecular characteristics and outcomes of stem cell transplantation in ZAP70 deficiency: a single-center experience

本综述系统总结了ZAP70缺陷（一种罕见T+B+NK+联合免疫缺陷病）患者的临床、免疫学及分子特征，重点分析造血干细胞移植（HSCT）后的疗效与免疫重建情况。研究表明，清髓性预处理可促进更彻底的免疫重建，为临床治疗方案选择提供重要依据。

　　

引言

严重联合免疫缺陷病（SCID）是一组危及生命的先天性免疫错误，其特征是T细胞分化存在严重缺陷，通常伴有B细胞和/或自然杀伤（NK）细胞发育异常。SCID的临床表型通常较为一致，表现为早发性严重反复感染、间质性肺炎、口腔念珠菌病和慢性腹泻，并常伴有生长迟缓。SCID包含遗传和临床异质性的一组疾病，目前已发现超过22种不同的遗传缺陷。其中，若干SCID相关基因突变涉及T细胞受体（TCR）信号传导的破坏。在抗原识别后，TCR复合物通过非受体胞质蛋白酪氨酸激酶（PTKs），特别是Lck和ζ链相关蛋白激酶70kDa（ZAP70）传递细胞内信号。

ZAP70是Syk家族的非受体PTKs的胞质成员，主要在T细胞中表达，在其发育和激活中起关键作用。在结构上，ZAP70由两个串联的SH2结构域和一个羧基末端激酶结构域组成。TCR结合后，ZAP70的SH2结构域与TCR ζ链上的磷酸化免疫受体酪氨酸-based激活基序结合，将ZAP70募集到激活的复合物中。随后，ZAP70磷酸化关键下游分子，包括SLP-76和LAT，从而启动对T细胞激活、分化、细胞因子产生、粘附和运动至关重要的信号级联。激活的ZAP70还参与各种淋巴细胞亚群的功能调节，包括γδ T细胞、NK细胞、MAIT细胞、初始和记忆CD8⁺ T细胞、调节性T细胞和初始CD4⁺ T细胞。重要的是，ZAP70在CD8⁺胸腺细胞的正向选择中起核心作用，而CD4⁺ T细胞的发育相对保留，这是由于相关激酶Syk的补偿，其在人胸腺细胞中的表达高于小鼠胸腺细胞。在ZAP70缺陷患者中，胸腺组织学通常显示皮质中存在CD4⁺CD8⁺双阳性细胞，但髓质中主要为CD4⁺单阳性细胞。因此，ZAP70蛋白的缺失导致人类选择性CD8⁺ T细胞缺陷伴CD4⁺ T细胞信号转导受损，而在小鼠模型中，完全ZAP70缺陷由于Syk表达不足导致CD4⁺和CD8⁺ T细胞发育停滞。

ZAP70缺陷于1994年首次被描述为一种SCID形式，其特征是淋巴细胞增多伴选择性CD8⁺ T细胞缺陷和CD4⁺ T细胞功能缺陷。ZAP70缺陷最初在门诺派教徒血统的患者中发现，随后在其他种族中发现，包括西班牙裔、日本裔、库尔德裔、土耳其裔、葡萄牙裔、白种人、墨西哥裔、马达加斯加裔和伊朗裔患者。大多数患者最初诊断为SCID。ZAP70缺陷患者表现出一系列临床表现，包括反复呼吸道感染、皮炎或慢性腹泻，他们需要造血干细胞移植（HSCT）才能生存。ZAP70缺陷是一种极其罕见的SCID形式，迄今为止报道的病例数量有限。本研究描述了在单一三级医疗中心治疗的13例先前未发表的ZAP70缺陷患者的临床、免疫学和遗传特征，以及移植结果和HSCT后免疫重建。

方法

患者

这项回顾性图表审查涉及2000年至2024年间在国王费萨尔专科医院和研究中心的免疫缺陷诊所诊断并随访的所有经基因证实的ZAP70缺陷患者。我们评估了所有患者的临床、免疫学和遗传特征；HSCT细节；移植后结果；以及最近随访时的免疫重建。该研究获得了KFSHRC机构审查委员会的批准。从患者或未成年人的法定监护人处获得了书面知情同意，以发布本文中包含的任何可能可识别的图像或数据。

细胞和免疫学检测

使用免疫荧光染色和流式细胞术分析外周血白细胞亚群。使用了针对T细胞（CD3、CD4、CD8）、NK细胞（CD16、CD56）和B细胞（CD19）的单克隆抗体。通过评估对植物血凝素（PHA）刺激的增殖反应来体外评估T细胞功能能力。通过比浊法测量血清免疫球蛋白（Ig）水平，包括IgG、IgA和IgM。

ZAP70测序

从作为常规临床实践一部分通过静脉穿刺从患者及其父母收集的外周血样本中提取基因组DNA。在早期病例（2000-2016年）中，基于临床怀疑对ZAP70进行了Sanger测序，使用聚合酶链反应扩增后进行直接测序。从2016年起，采用下一代测序（NGS），通过靶向原发性免疫缺陷panel或全外显子组测序，并通过Sanger测序和家族分离分析进行变异确认。将序列读数与参考人类基因组进行比对，并识别和分析变异。为了确认已识别变异的新颖性，咨询了沙特人类基因组数据库以排除未报道的群体特异性单核苷酸多态性。此外，采用计算机预测工具评估已识别错义变异的潜在致病性。

预处理方案、移植和支持治疗

11名患者在中位年龄7个月时接受了HSCT。使用高分辨率分子分型在I类（HLA-A、HLA-B、HLA-C）和II类（HLA-DRB1、HLA-DQB1）位点评估HLA相容性。干细胞来源包括来自HLA匹配兄弟姐妹（3例）和HLA匹配父母（4例）的未处理骨髓，以及一名无关脐带血供者。患者P9接受了其父亲的移植，患者P10接受了其兄弟的移植，各自存在单个HLA抗原错配。患者P4在HLA位点为纯合子，接受了其母亲的移植，该母亲被认为在移植物抗宿主病（GVHD）风险方面完全匹配，但在排斥方面是单倍体相同。八名患者因就诊时存在活动性感染而未进行移植前预处理接受了HSCT，而三名患者接受了预处理方案，包括P4和P11使用氟达拉滨、美法仑和抗胸腺细胞球蛋白（ATG）；P10使用白消安和环磷酰胺；以及P8因初始无预处理HSCT失败后第二次移植使用白消安、氟达拉滨和ATG。在相关供体移植中，输注的CD34⁺干细胞数量范围为3.75 × 10⁶至10 × 10⁶/kg。在脐带血移植受者（P11）中，输注了0.11 × 10⁶/kg CD34⁺细胞和5.15 × 10⁸/kg总有核细胞。P4的第一次移植采用降低强度预处理，由于免疫重建不理想，在移植后2年接受了干细胞加强。来自HLA匹配兄弟姐妹的无预处理移植患者未使用GVHD预防，而来自HLA匹配父母的无预处理移植使用了环孢素（CSA）。在接受预处理的患者中，GVHD预防包括钙调神经磷酸酶抑制剂CSA（P4、P9、P10、P11）和他克莫司（P8）、甲氨蝶呤（P8、P10）和霉酚酸酯（P9、P11），并且为无关脐带血移植受者（P11）添加了皮质类固醇。患者在移植期间被安置在正压隔离室中。与再生障碍相关的发热发作使用经验性静脉抗生素治疗。根据临床指示输注经照射、巨细胞病毒（CMV）阴性的红细胞和血小板进行血液学支持。对CMV阴性受体与CMV阳性供体进行先发性抗病毒预防，静脉注射阿昔洛韦（1500 mg/m²/天，持续60天）。所有患者接受G-CSF（5 μg/kg/天）直至绝对中性粒细胞计数超过0.5 × 10⁹/L，并每3周接受静脉注射免疫球蛋白（IVIG）。使用短串联重复分型监测嵌合体。急性和慢性GVHD的诊断遵循既定共识标准，并在必要时通过组织病理学确认。所有患者接受皮质类固醇作为一线治疗，并根据需要使用额外的免疫调节治疗。

免疫重建

免疫重建定义为临床、细胞、功能和体液恢复的综合。临床重建包括解决反复或严重感染、清除既往存在的病毒感染（如CMV、EBV）以及能够停止抗菌预防。细胞重建定义为CD3⁺ T细胞计数正常化（>1,000/μL）并恢复CD8亚群。功能重建通过恢复对丝裂原刺激的T细胞增殖反应（≥对照的10%）来证明。体液重建定义为摆脱IVIG替代、血清免疫球蛋白水平（IgG、IgA和IgM）持续正常化以及证明保护性疫苗特异性抗体反应。持久的供体淋巴样嵌合体也被认为是成功重建的支持性证据。

结果

患者特征和临床表现

本研究包括来自九个无关家庭的十三名经基因证实的ZAP70缺陷患者。所有13名患者均出生于近亲父母，该队列的近亲结婚率为100%。队列包括七名男孩和六名女孩。12名患者（92.3%）有提示原发性免疫缺陷的阳性家族史，三名患者因家族史通过靶向新生儿筛查被诊断。诊断时的中位年龄为4个月。所有患者均表现出慢性皮炎，最常见的是湿疹样特征。11名患者（84.6%）有反复呼吸道感染，而八名（61.5%）有慢性腹泻。5名患者（38.5%）发生CMV感染，其中两名发展为CMV视网膜炎。两名患者（15.4%）记录有 Epstein-Barr病毒（EBV）病毒血症。在四名患者（30.8%）中检测到卡介苗（BCG）疫苗相关并发症，包括三名局部BCG炎和一名播散性疾病。五名患者观察到淋巴结病，伴或不伴肝脾肿大。七名患者表现出生长迟缓或体重增加不良，主要归因于慢性胃肠道症状。两名患者（15.4%）表现出自身免疫表现，形式为自身免疫性溶血性贫血和肾病综合征。

免疫学特征

整个队列的中位白细胞计数为11.0 × 10⁹/L，中位绝对中性粒细胞计数（ANC）为2.79 × 10⁹/L，中位绝对淋巴细胞计数为5.18 × 10⁹/L。CD8⁺ T细胞淋巴细胞减少是一个一致的诊断线索，在11名患者（84.6%）中观察到，CD8⁺计数范围0–92个细胞/mm³。值得注意的是，两名患者（P2和P3）的CD8⁺ T细胞计数按年龄正常（中位数715.5个细胞/mm³）。其他淋巴细胞亚群的中位计数如下：CD3⁺ T细胞2618个细胞/mm³；CD4⁺ T细胞2481个细胞/mm³；CD19⁺ B细胞636个细胞/mm³；和CD56⁺/CD16⁺ NK细胞449个细胞/mm³。对六名患者进行了针对PHA刺激的淋巴细胞增殖测定，并发现与健康对照相比反应严重降低（0%–1%）。大多数患者的血清Ig水平通常在正常范围内。然而，两名患者表现出低IgA水平，一名患者IgM水平降低。

分子遗传学检测

所有十三名患者均被发现携带ZAP70纯合突变。八名患者（P2、P3、P4、P5、P7、P8、P9和P10）来自同一部落的四个不同家庭，携带先前报道的错义突变：NM_001079.4: c.1606G>A: p.Gly536Ser。该突变导致激酶结构域中的非极性中性甘氨酸被极性中性丝氨酸残基替换。患者P1携带外显子5的纯合错义突变（c.569G>C; p.R190T），将氨基酸从精氨酸（碱性氨基酸）变为苏氨酸（中性氨基酸）。来自无关部落的两名患者（P11和P12）携带剪接位点突变c.1082 + 2T>C，预计会破坏正常剪接。在两名患者中鉴定出纯合移码缺失。P6有c.492delC: p.His165fs，导致组氨酸到苏氨酸的替换随后移码，而P13有c.1332_1338delGGTGTCC: p.Val445fs*3，导致三个氨基酸下游的提前终止密码子。所有变异均通过Sanger测序确认，家族分离分析验证了每个突变与疾病表型共分离，模式符合常染色体隐性遗传。

HSCT植入、生存和毒性

11名患者共接受了13次HSCT程序。中位随访时间7年，移植后总生存率为72.7%（8/11）。三名患者（P9、P10、P11）死于移植相关并发症，包括一名患者（P9）败血症和两名患者（P10、P11）急性呼吸窘迫综合征。在接受预处理方案的患者中，中性粒细胞恢复（ANC > 0.5 × 10⁹/L）的中位时间为+26天，血小板恢复（>20 × 10⁹/L无需输血）的中位时间为+23.5天。两名患者发生急性GVHD。具体而言，P5和P11出现皮肤GVHD，P11还出现肝脏和胃肠道受累。所有病例均经活检证实，患者对全身性皮质类固醇有反应。未观察到慢性GVHD。感染并发症很常见，影响63.6%（7/11）的患者。这些包括CMV病毒血症、EBV病毒血症和败血症。患者P4接受了降低强度预处理，经历了不良的免疫重建，伴有持续性CMV病毒血症和自身免疫性溶血性贫血（AIHA）。随后的干细胞加强导致了免疫恢复和CMV清除。该患者的AIHA通过利妥昔单抗和IVIG得到控制，他继续接受治疗。患者P8第一次移植未进行预处理，出现了AIHA和与肾小球肾炎相关的类固醇抵抗性肾病综合征，被认为是移植失败或免疫重建不足的迹象。她随后使用清髓性预处理方案从同一供体接受了第二次移植，实现了完全供体嵌合（100%）并完全解决了自身免疫。移植后1年，她已停用所有免疫抑制和支持治疗。接受无预处理或降低强度预处理移植的患者显示部分供体淋巴样嵌合（38%–94%），但无供体髓样植入。相反，接受清髓性预处理的患者（P8）在淋巴样和髓样区室均实现了100%供体嵌合。

免疫重建

在最后一次随访时，八名存活患者在HSCT后显示出免疫重建的证据，这通过临床改善和免疫学恢复得到证明。临床上，这些患者显示反复感染解决，病毒再激活清除，并且能够停止抗菌预防。在免疫学上，大多数实现了CD3⁺ T细胞计数正常化，CD8⁺ T细胞计数部分恢复（范围106–771个细胞/mm3），在测试患者中恢复了丝裂原诱导的T细胞增殖以及稳定的供体淋巴样嵌合。七名患者停止了IVIG替代，并且能够维持正常的血清IgG、IgA、IgM水平以及产生保护性疫苗特异性抗体反应。一名患者（P2）表现出部分功能重建，丝裂原诱导的T细胞增殖仍然不理想（对照的7%），尽管达到了足够的CD8⁺ T细胞计数并且在临床上保持良好无感染。

讨论

ZAP70缺陷是一种罕见的常染色体隐性遗传联合免疫缺陷病，其特征是TCR信号传导中断，主要影响CD8+ T细胞发育和功能。该疾病目前被认为是SCID谱系中的一个独特实体，具有高度可变的表型，范围从经典的早发性SCID到晚发性免疫失调。由于其罕见性，临床经验仍然有限，并且治疗实践，特别是关于HSCT的实践，正在不断发展。本研究提出了最大的经基因证实的ZAP70缺陷单中心队列，为了解该疾病的临床、免疫学和遗传特征以及HSCT结果和免疫重建提供了宝贵的见解。

ZAP70基因编码一种对TCR信号传导至关重要的酪氨酸激酶。先前的报告描述了49名患者中的32种不同突变，大多数是纯合或复合杂合，分散在整个基因中，没有明显的基因型-表型相关性。在我们的13名患者队列中，鉴定出五种不同的纯合突变。值得注意的是，G536S变体在八名个体中发现，表明我们地区人群中存在奠基者效应。尽管G536S与我们队列中的经典SCID特征和非典型表现相关，但这反映了更广泛的观察结果，即临床严重程度可能无法直接由基因型预测。其余突变是各个家庭独有的。

2020年对49名ZAP70缺陷患者的系统评价报告了广泛的临床表现，包括反复呼吸道感染（81.8%）、皮肤受累（57.9%）、淋巴组织增生（32.4%）、自身免疫（19.4%）、肠病（18.4%）和恶性肿瘤（8.1%）。感染主要是病毒性的（CMV、EBV、水痘、轮状病毒），但也检测到细菌、真菌和分枝杆菌病原体（例如BCG炎、耶氏肺孢子菌）。还记录了自身免疫并发症，包括血细胞减少、肾炎和肠病。我们队列的临床表现与先前报告的病例重叠，但也揭示了新特征。尽管反复呼吸道感染、慢性腹泻、生长迟缓和皮炎是常见的表现 signs，但我们也在一些患者中观察到过敏表型，包括食物过敏和过敏性鼻炎。这些发现在以前的队列中没有广泛报道，可能反映了部分功能性T细胞中潜在的Th2偏斜或失调的免疫反应。此外，在携带相同突变的三名无关患者中检测到自身免疫现象，包括血细胞减少和肾病综合征，这引发了关于与特定变体或部落基因库相关的免疫耐受缺陷的问题。基因诊断的中位年龄为4个月，早于报告的7.5个月中位数。

在免疫学上，CD8⁺淋巴细胞减少仍然是ZAP70缺陷的标志，在超过95%的病例中报道。类似地，我们研究中的13名患者中有11名表现出显著降低的CD8⁺ T细胞计数。然而，两名患者（P2和P3）分别在5岁和6岁时较晚出现，其CD8⁺计数按年龄正常，但表现出对丝裂原刺激的T细胞增殖反应严重受损。值得注意的是，两名患者都携带G536S突变，该突变也在其他具有经典早发性疾病和严重CD8⁺淋巴细胞减少的个体中发现，强调了与该基因型相关的表型变异性。最近报道了一名具有高CD8⁺计数的类似ZAP70缺陷患者，尽管基因变体不同。这些观察结果突出了将免疫表型分析与功能测定（如淋巴细胞增殖测试）相结合，并利用无偏遗传方法（包括原发性免疫缺陷基因panel或全外显子组测序）对于及时准确诊断的重要性，特别是在非典型或晚发性病例中。

我们队列中的免疫球蛋白水平通常正常，与文献报告一致，但对疫苗的特异性抗体反应通常缺乏。这种功能性体液损伤强调了在明确HSCT治疗之前，早期Ig替代和感染预防在疾病管理中的重要性。正如预期，在大多数患者中，丝裂原诱导的淋巴细胞增殖（例如对PHA）严重降低，突出了该测试在评估疑似病例中T细胞功能的效用。

ZAP70缺陷中自身免疫的发病机制日益被认识到，并且可能是多因素的。动物模型和人类研究表明，调节性T细胞生成和功能缺陷、CTLA-4和TGF-β表达减少以及由于Th2分化受损导致的IL-10产生不良。在我们队列中，自身免疫性血细胞减少和肾病综合征在来自同一部落、携带相同突变的两名无关患者中观察到。如先前研究报道，自身免疫表现可发生在ZAP70缺陷患者中。例如，一份病例报告描述了一名3岁儿童出现自身免疫性血小板减少症和溃疡性结肠炎，说明了受影响个体中存在显著免疫失调的可能性。尽管自身免疫可能因早期死亡率而被低估，但其在我们队列和其他研究中的存在表明需要持续监测，并可能代表非典型或晚发性表现中的临床线索。

HSCT仍然是ZAP70缺陷的唯一治愈性治疗方法。早期移植，理想情况下在发生显著感染或器官损伤之前，提供了免疫重建和长期生存的最佳机会。然而，由于诊断延迟和供体可用性有限，许多患者在次优条件下接受HSCT。迄今为止，已报告大约25名患者成功进行了HSCT，报告的生存率超过90%，尽管大多数病例没有详细的移植程序和长期结果数据。Cuvelier等人报告了八名接受HSCT的ZAP70缺陷患者的长期结果，中位随访时间为13.5年。其中三名患者接受了来自HLA匹配兄弟姐妹供体的无预处理骨髓移植。这些个体发展出持续的混合T细胞嵌合，但在B细胞和髓系谱系中表现出不良或缺乏植入。值得注意的是，尽管缺乏完全多谱系植入，所有三人都实现了正常的血清Ig水平，在移植后疫苗接种后产生了保护性抗体反应，并成功停止了Ig替代治疗。其余五名患者接受了清髓性预处理，包括三名接受T细胞去除的单倍体相同移植和两名接受无关供体脐带血移植的患者，并在T细胞、B细胞和髓系区室中证明了完全供体嵌合。HSCT后，五名患者的CD8⁺ T细胞计数正常，一名患者升高，两名患者降低。重要的是，所有八名患者都表现出对PHA刺激的正常淋巴细胞增殖反应，并且七名不再需要Ig替代。

我们的经验突显了为ZAP70缺陷选择最佳HSCT策略的复杂性。结果受到供体类型、预处理强度和患者移植时临床状态的强烈影响。无预处理的HLA匹配兄弟姐妹供体实现了生存伴部分淋巴样嵌合，这足以恢复T细胞功能并预防感染。然而，这些患者通常缺乏髓系植入，引发了关于长期耐久性的问题。相比之下，单倍体相同或错配相关供体移植与较高的移植相关死亡率相关，特别是在移植时存在活动性感染的患者中。清髓性预处理方案虽然毒性更大，但导致跨造血谱系的完全供体嵌合和更完全的免疫重建，如患者P8需要第二次移植所说明。重要的是，预处理必须个体化：在存在持续感染或器官功能障碍的患者中，无预处理或降低强度的方法可能作为挽救生命的选项，特别是在T细胞充足移植物或HLA匹配供体的情况下。总体而言，我们的研究结果表明，虽然无预处理或降低强度方案在选定的高风险患者中有一席之地，但清髓性预处理在临床可行时仍然是实现持久多谱系植入的最可靠策略。

这项研究有几个局限性。首先，移植患者数量少（n=11），反映了ZAP70缺陷的罕见性。因此，未进行正式的生存分析（例如Kaplan-Meier曲线）或亚组比较，因为结果将效力不足并且受到我们队列异质性的混淆。患者在HSCT时的年龄、供体类型、预处理强度以及移植时的临床状态（包括活动性感染和器官功能障碍的存在）差异很大。这些差异会显著影响结果，并可能使统计比较产生误导。相反，我们选择了一种描述性方法，突出临床有意义的模式而不夸大结论。其次，所有患者均在高度近亲繁殖人群中具有区域奠基者突变效应的单一三级转诊中心接受治疗。虽然这提供了对基因型-表型相关性的宝贵见解，但可能限制我们研究结果对更多遗传多样化人群的普遍性。因此，协作的多中心研究对于验证这些观察结果和完善ZAP70缺陷的移植策略至关重要。

结论

ZAP70缺陷呈现出广泛的临床和免疫学特征，包括非典型表型，如正常CD8⁺计数和过敏或自身免疫表现。高度临床怀疑，特别是在具有反复感染和CD8⁺淋巴细胞减少或淋巴细胞功能异常的近亲繁殖人群中，对于早期诊断至关重要。HSCT仍然是明确的治疗方法。清髓性预处理与更完全的免疫重建相关，但无预处理移植可能适用于有强化方案禁忌症的患者。鉴于这种疾病的罕见性，需要协作的多中心努力来完善移植方案并进一步表征长期结果。

缩写列表

SCID，严重联合免疫缺陷病；HSCT，造血干细胞移植；HLA，人类白细胞抗原；GVHD，移植物抗宿主病；TCR，T细胞受体；KFSHRC，国王费萨尔专科医院和研究中心；PHA，植物血凝素；BCG，卡介苗；ATG，抗胸腺细胞球蛋白；CMV，巨细胞病毒；EBV，Epstein-Barr病毒；IVIG，静脉注射免疫球蛋白；AIHA，自身免疫性溶血性贫血；Ig，免疫球蛋白；PTK，蛋白酪氨酸激酶；ZAP70，ζ链相关蛋白激酶70kDa；CSA，环孢素；ANC，绝对中性粒细胞计数；NK，自然杀伤细胞；VOD，静脉闭塞性疾病；LAP，淋巴结病。