高凝状态通过CCR6+OLFM4+肠道干细胞亚群调控克罗恩病严重程度的机制：回肠转录组与单细胞研究

本研究发现克罗恩病（CD）患者的高凝状态通过激活CCR6+OLFM4+肠道干细胞亚群，经PI3K-Akt信号通路加剧疾病进展。通过整合转录组学（GEO数据库）与单细胞测序（154,136个上皮细胞），首次揭示该干细胞亚群在高凝状态下扩增2.3倍（P<0.05），并显著富集凝血-免疫交互通路。研究为CCR6-PI3K-Akt轴作为治疗靶点提供新依据，对CD个体化治疗具有重要临床意义。

　　

1 引言

凝血功能与先天免疫的交互作用已成为炎症性疾病研究的焦点，特别是在克罗恩病（Crohn's disease, CD）中。CD是一种慢性全身性胃肠道炎症性疾病，其疾病进展以不可预测的缓解-复发循环和严重并发症为特征。现有证据表明CD患者处于获得性高凝状态，易发生深静脉血栓和肺栓塞等血栓栓塞事件，且这种状态在疾病严重、接受免疫抑制治疗（如皮质类固醇）和长期卧床的患者中尤为明显。炎症微环境通过促进内皮功能障碍和血小板活化加剧血栓形成风险，形成炎症与凝血的恶性循环。肠道微血管系统中的微血栓可能加剧局部炎症，导致纤维化和疾病并发症。因此，阐明CD中凝血与炎症联系的分子机制对开发靶向治疗至关重要。

2 方法

研究纳入78例CD患者（中国南方医院），诊断符合标准 criteria。使用GEO数据库中三个独立回肠样本数据集（GSE193677、GSE137344和GSE186582）作为发现与验证队列。通过AmiGO 2和KEGG数据库筛选凝血相关基因（coagulation-related genes, CRGs），最终获得300个CRGs。差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）分析采用limma包（adj. P<0.05, |log2FC|>0.5）。基于CRGs进行共识聚类分析，计算凝血评分（Hallmark_coagulation score）。利用CIBERSORT评估免疫细胞浸润。分析公共单细胞RNA测序数据（DUOS-000146），使用Seurat包（v4.0）进行细胞聚类和注释。免疫荧光染色验证CCR6⁺OLFM4⁺细胞定位。统计分析和可视化使用R（v4.2.1）和GraphPad Prism（v10.1.2）。

3 结果

3.1 临床评估与凝血参数、炎症标志物及疾病活动的关联

CD患者炎症标志物显著升高：C反应蛋白（C-reactive protein, CRP）（53.7±68.400 mg/L）、降钙素原（procalcitonin, ProCT）（0.6±2.557 ng/mL）和红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate, ESR）（19.6±17.168 mm/1h）。血小板计数与克罗恩病活动指数（Crohn's Disease Activity Index, CDAI）正相关（r=0.281, P=0.013），与ESR正相关（r=0.424, P<0.001）。D-二聚体和纤维蛋白原（fibrinogen, FIB）水平也与ESR正相关（r=0.399, P=0.002；r=0.496, P<0.001）。按疾病活动度分层后，中度活动组血小板计数、D-二聚体和FIB水平均显著高于非活动组（P<0.05）。

3.2 CD患者的遗传变异与功能变化

发现数据集（234例CD，142例对照）鉴定出3,553个DEGs（2,247个上调，1,306个下调）。GO富集分析显示显著富集于免疫球蛋白复合体、免疫反应介质产生、CCR趋化因子受体结合和血液凝固等通路。KEGG分析显示DEGs富集于中性粒细胞胞外诱捕网形成、癌症中的转录失调等通路。这些结果证实CD患者存在免疫浸润和凝血通路激活。

3.3 基于凝血评分的CD患者疾病严重程度差异

GSVA分析显示CD组织凝血评分显著高于对照（P<0.001），且评分随疾病活动度增加而升高。通过64个重叠CRGs将患者分为两个亚群：Cluster 1（76例）和Cluster 2（158例）。PCA证实两群分布差异，Cluster 2具有更高凝血评分和更严重疾病（P<0.01）。

3.4 凝血亚群间生物功能通路的变化

Cluster 2 vs Cluster 1鉴定出3,816个DEGs（1,061个上调，2,755个下调）。GO分析显示Cluster 2富集于IgA/IgG免疫球蛋白复合体、G蛋白偶联受体结合、CCR6趋化因子受体结合、Notch信号通路和干细胞增殖等通路。KEGG分析显示PI3K-Akt信号通路、Notch信号通路和核糖体通路富集。凝血评分与Notch信号（rho=0.15, P=0.024）、PI3K-Akt信号（rho=0.22, P<0.001）和干细胞增殖（rho=0.26, P<0.001）正相关。CXCR4和CCR6表达与凝血评分正相关（P<0.05），且随疾病严重度升高。

3.5 验证队列中凝血通过PI3K-Akt信号通路与CD进展相关

验证队列（GSE186582）中，64个CRGs将患者分为Cluster 1（111例）和Cluster 2（85例）。Cluster 2凝血评分更高（P<0.001），DEGs分析显示1,111个上调基因与发现队列重叠（一致性79.13%）。GO和KEGG分析再次证实PI3K-Akt信号通路富集（P<0.05）。

3.6 高凝状态对CD患者回肠上皮干细胞的影响

单细胞分析（154,136个上皮细胞）鉴定出4个OLFM4⁺干细胞亚群：stem cells OLFM4、stem cells OLFM4 GSTA1、stem cells OLFM4 LGR5和stem cells OLFM4 PCNA。除stem cells OLFM4外，其余亚群在炎症样本中显著扩增（P<0.05）。GSVA显示这些干细胞在高凝状态下凝血评分和PI3K-Akt信号通路表达升高。其中，stem cells OLFM4 GSTA1表现出最高凝血评分和PI3K-Akt激活（P<0.01），且CCR6在该亚群显著上调（P<0.05）。免疫荧光证实高凝CD患者上皮层CCR6⁺OLFM4⁺双阳性细胞增加2.3倍（P<0.05）。伪时间轨迹分析显示CD患者干细胞分化程度更高（P<0.01），且PI3K-Akt活性随分化进程上调（P<0.05）。

3.7 高凝状态对CD患者炎症的增强作用

免疫浸润分析显示Cluster 2中记忆B细胞、记忆活化CD4 T细胞、M0/M1巨噬细胞和中性粒细胞比例更高（P<0.05），而记忆静止CD4 T细胞、M2巨噬细胞和静止肥大细胞比例降低。凝血评分与记忆B细胞（rho=0.36, P<0.001）、记忆活化CD4 T细胞（rho=0.39, P<0.001）和M1巨噬细胞（rho=0.17, P=0.011）正相关，与记忆静止CD4 T细胞（rho=-0.19, P=0.003）和M2巨噬细胞（rho=-0.21, P=0.013）负相关。

4 讨论

本研究首次鉴定CCR6⁺OLFM4⁺肠道干细胞作为CD中凝血与炎症交互的新型细胞界面。该亚群在高凝回肠组织中选择性扩增，与微血栓病变共定位，并呈现CCR6过表达和PI3K-Akt激活的独特转录特征。机制上，CCR6-CCL20轴已知参与上皮病理生理，而PI3K-Akt信号促进干细胞存活和增殖——这些过程在高凝患者中均被富集。研究提出模型：凝血因子（如凝血酶或纤维蛋白原）创造微环境促使CCR6⁺干细胞扩增，进而通过PI3K-Akt驱动细胞因子产生放大局部炎症。这些发现具有转化意义：现有抗凝剂可能通过调节肠道干细胞巢发挥益处；CCR6成为潜在治疗靶点，多种CCR6抑制剂已用于其他炎症性疾病的临床试验。研究支持在凝血标志物升高的CD患者中测试这些制剂。未来研究应优先开展类器官模型验证CCR6敲除是否消除凝血诱导的PI3K-Akt激活，以及按凝血状态分层设计CCR6靶向治疗的临床试验。研究局限性包括观察性数据无法确立因果关系，需前瞻性研究验证。空间转录组学可精确定位CCR6⁺OLFM4⁺细胞与血栓灶的关系。伪时间分析显示PI3K-Akt活性在分化过程中持续上升，但需功能实验验证表型变化的阈值效应。总之，本工作通过揭示CCR6⁺OLFM4⁺肠道干细胞作为凝血信号向促炎反应的细胞转导器，增进了对CD发病机制的理解。CCR6-PI3K-Akt轴作为统一机制，可解释CD患者的血栓并发症和抗凝治疗反应，为该轴作为疾病分层生物标志物和靶向治疗提供新方向。