功能性分析MEIS2剪接位点变异c.438+1G>T在先天性心脏病中的分子机制与诊断价值

本研究通过全外显子测序（WES）和迷你基因剪接实验，首次报道MEIS2基因c.438+1G>T新发剪接位点变异导致先天性心脏病（CHD）的分子机制。研究发现该变异引发两种异常剪接模式（内含子保留和外显子跳跃），导致蛋白质截短，为CHD的遗传诊断和咨询提供了新的分子标志物。

　　

引言

先天性心脏病（CHD）是新生儿中较为常见的先天性畸形，也是出生缺陷相关死亡的主要原因，其患病率约为0.8%–1.2%。病因复杂，涉及遗传、非遗传和环境因素，其中遗传变异尤为重要。本研究报道一例CHD合并发育迟缓患儿，通过全外显子测序（WES）和Sanger测序发现MEIS2基因存在杂合c.438+1G>T变异，该突变位于内含子4的剪接供体位点，为未在ClinVar或HGMD数据库中记录的新发突变。根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南，该变异被初步归类为致病性，但缺乏功能验证数据。本研究旨在通过功能性分析验证MEIS2 c.438+1G>T的致病性及其与心脏畸形的关联。

材料与方法

临床信息

研究对象为2023年2月就诊于宁夏医科大学总医院心血管外科的一名CHD伴发育迟缓患儿。男性，1岁8个月，汉族，10个月时曾行单侧腹股沟隐睾手术。超声心动图显示房间隔缺损（继发孔型）。患儿存在发育和语言迟缓、反应迟钝、活动量低、协调性差（Bayley III评分78分，提示轻度至中度障碍）。体格检查发现胸骨左缘第2、3肋间收缩期杂音。无家族遗传病史。父母均为25岁，非近亲结婚。采集先证者及其父母外周血进行WES和Sanger测序，并检测30例心脏相关疾病患者和100名健康人，均未发现MEIS2 c.438+1G>T变异。本研究经宁夏医科大学总医院生殖医学中心伦理委员会批准（批准号：SZLL20230202）。

遗传分析

使用QIAamp DNA Blood Midi/Mini Kit提取基因组DNA，Qubit 4.0荧光计测定浓度和纯度。构建测序文库后，使用NovaSeq 6000平台进行PE150测序。数据过滤后与人类参考基因组（hg19）比对，使用GATK和Verita Trekker进行变异检测，并通过dbSNP、1000 Genomes、ClinVar等数据库及SIFT、PolyPhen-2、GERP等工具进行注释和功能预测。使用Primer Z设计MEIS2引物，PCR扩增后通过Sanger测序（ABI 3730）验证突变位点。同时使用RDDC和SpliceAI等软件进行剪接预测。

迷你基因分析

从先证者基因组DNA中扩增MEIS2的Exon3（142bp）-Intron3（674bp）-Exon4（51bp）-Intron4（986bp）-Exon5（51bp）区域，分别克隆至pcDNA3.1和pcMINI-C载体。通过菌落PCR和Sanger测序验证重组载体。将野生型（WT）和突变型（MT）载体转染至HeLa和293T细胞，48小时后提取总RNA，反转录为cDNA，使用特异性引物进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳和Sanger测序分析。

结果

手术治疗

患儿经评估后行房间隔缺损封堵术。术中经食管超声显示房间隔缺损大小为8mm。经右胸第三肋间切口入胸，心包切开后于右心房置入双层 purse-string缝线，在超声引导下成功植入14mm封堵器。推拉试验显示封堵器位置稳定，形态满意，无分流或移位，各瓣膜启闭正常。

Sanger测序分析

WES检测到MEIS2基因杂合c.438+1G>T变异，Sanger测序证实为新发突变（父母未携带）。该变异位于内含子4的+1位点（c.438为外显子4的最后一个核苷酸G，剪接供体位点G>T替换），未被ClinVar或HGMD收录。根据ACMG指南，该变异分类为致病性（PVS1 + PM2 + PM6_Supporting）。

MEIS2 c.438+1G>T致病性分析

MEIS2基因含12个外显子，编码477个氨基酸的蛋白质。c.438+1G>T突变位于影响剪接的“I类突变区域”。生物信息学预测（RDDC评分0.9937，SpliceAI评分1.00）均提示该变异破坏剪接。迷你基因实验显示，WT产生单一正常条带，MT产生两条异常条带（HeLa和293T细胞一致）。Sanger测序证实MT存在两种异常剪接模式：① 保留内含子4的5′端290bp（c.438+1_438+290ins）；② 外显子4跳跃（c.388_438del）。

生物信息学分析

异常剪接对蛋白质翻译的影响：① 290bp内含子保留导致移码突变，在保留片段内引入提前终止密码子（PTC），预测产生175个氨基酸的截短蛋白（p.Met147Leufs*30）；② 外显子4跳跃未引起移码，但导致17个氨基酸内部缺失（p.Val130_Leu146del），预测产生460个氨基酸的截短蛋白。

讨论

导致CHD的突变基因主要在心脏发育早期起关键调控作用，包括心脏转录因子、心脏特异性基因和信号通路分子（如GATA4、IRX4、TBX5、MEIS2、ILS1、NKX2-5等）。MEIS2属于TALE家族转录因子，含homeodomain结构域，与常染色体显性遗传病相关。小鼠模型研究表明，MEIS2缺失导致胚胎致死，并引起颅面及心脏神经嵴细胞发育缺陷。斑马鱼MEIS2B同源基因敲低导致心脏形态发生异常。MEIS2致病变异通常导致三大核心临床特征：腭裂、房间隔和室间隔缺损、发育迟缓。其他表型包括原发性中性粒细胞减少、鳃弓异常和复杂生殖器畸形等。

近年来，MEIS2突变谱不断扩展，已报道超过20例新发致病变异，包括错义、无义和剪接位点变异等。本研究首次报道c.438+1G>T剪接位点变异，并通过功能实验验证其致病性。迷你基因实验显示该变异导致两种异常剪接（内含子保留和外显子跳跃），干扰正常蛋白质翻译。内含子保留直接反映内外调控因素的影响，可能与疾病易感性相关；外显子跳跃是最常见的可变剪接事件，常导致功能域丢失或移码突变，已成为治疗靶点。

本研究选用HeLa和293T细胞系基于其剪接机制研究中的广泛应用和高转染效率，但观察到剪接模式可能无法完全代表MEIS2在心脏组织（特别是发育中的心脏）中的精确调控。未来使用心脏特异性细胞系（如H9c2心肌细胞或iPSC来源的心肌细胞）将更准确模拟该基因对心脏功能的影响。

作为心脏外科医生，除手术外，向家庭提供复发风险咨询至关重要。本案例通过WES明确致病原因，建议患儿父母尽早开始康复训练以改善功能状态。遗传咨询应包括仔细筛查母系CHD家族史以排除未患病父母的嵌合体，并推荐产前诊断以降低遗传突变和新生出生缺陷风险。本研究通过分析CHD患者扩展了MEIS2基因突变谱，强调心脏外科医生不仅修复解剖缺陷，还助力致病突变鉴定，支持早期诊断、指导康复和生殖决策，具有重要临床价值。