胸苷激酶1（TK1）通过调控细胞周期与EMT信号通路促进胶质母细胞瘤进展：基于多组学分析与实验验证的Prolif-like T细胞机制研究

本研究通过整合scRNA-seq与stRNA-seq等多组学数据，首次揭示Prolif-like T细胞在胶质母细胞瘤（GBM）免疫微环境中的关键作用。研究发现TK1作为该细胞亚群的核心标志物，通过调控细胞周期（Cyclin A1/B1）和上皮间质转化（EMT）信号（N-Cadherin/Vimentin）驱动肿瘤恶性进展，实验验证表明靶向TK1可显著抑制GBM增殖与迁移，为免疫治疗提供了新靶点。

　　

背景

胶质母细胞瘤（GBM）作为成人中最常见且最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤，被归类为神经胶质瘤分级系统中的IV级。其年发病率占所有胶质瘤病例的54%以上，分子病理特征表现为IDH野生型、7号染色体扩增/10号染色体缺失、TERT启动子突变、EGFR扩增和PTEN突变等改变。尽管采用以手术为基础的综合治疗策略，包括最大安全切除术后联合放化疗及替莫唑胺辅助治疗，肿瘤复发仍几乎不可避免，中位无进展生存期仅为6.9-7.5个月，中位总生存期约15-18个月。免疫检查点抑制剂（如nivolumab）在GBM中的疗效有限，这可能与肿瘤相关的免疫抑制微环境密切相关。

近年来，针对T细胞的免疫治疗策略展现出潜力，但GBM独特的免疫抑制微环境严重限制了T细胞的抗肿瘤活性。GBM肿瘤微环境（TME）以显著免疫抑制为特征，表现为T细胞浸润不足和功能严重受损。TGF-β在GBM TME中高表达，不仅抑制T细胞增殖和效应功能，还促进调节性T细胞（Tregs）的扩增，进一步抑制抗肿瘤 immunity。此外，GBM中关键色氨酸代谢酶IDO1的活性升高导致局部色氨酸耗竭和毒性代谢物积累，这些物质抑制T细胞活性并促进Treg分化。髓源性抑制细胞（MDSCs）在GBM中高度浸润，通过产生精氨酸酶、活性氧和一氧化氮来抑制T细胞功能。

值得注意的是，即使T细胞浸润到GBM TME中，其功能状态也常处于"衰竭"状态，表现为多种抑制性受体（PD-1、TIM-3和LAG-3）持续高表达，以及产生效应细胞因子（IFN-γ和TNF-α）的能力降低。Prolif-like T细胞是衰竭前体T细胞的一个独特亚群，既能产生新的效应T细胞，也能分化为终末衰竭T细胞。这一细胞群的出现可能标志着T细胞衰竭的开始，最近被确定为抗肿瘤免疫应答的关键调控节点和免疫检查点阻断治疗反应的决定性因素。然而，这一T细胞亚群在GBM TME中的作用仍不清楚。

材料与方法

本研究从GEO数据库收集了六个GBM scRNA-seq数据队列，包括GSE103224、GSE138794、GSE141383、GSE162631、GSE223063和GSE235676，共43个GBM样本。使用Seurat包读取这些数据集（min.cells = 3, min.features = 200）并进行质量控制（nCount_RNA ≥ 1000, nFeature_RNA: 200-8000, percent.mt ≤ 20），随后合并成一个scRNA-seq数据集。该数据集共包含149,002个细胞，每个细胞进行了45,131个基因的mRNA检测。

合并后的scRNA-seq数据集使用LogNormalize方法进行标准化，识别了2,000个高变基因并进行标准化。基于高变基因对数据集进行PCA降维分析，并去除批次效应。使用FindClusters方法对数据集进行聚类，得到52种细胞类型（编号0-51）。基于已知细胞标志物基因对这52种细胞类型进行手动注释，得到12个主要细胞簇和一个未知细胞簇。使用findmarker功能识别细胞亚型特异性标志物（only.pos=T, min.pct=0.25, logfc.threshold=0.25），进一步获得与Prolif-like T细胞相关的增殖相关标志物（log2fc > 0.585），共得到593个基因。

本研究应用CellChat方法和CellPhoneDB数据分析scRNA-seq数据中与Prolif-like T细胞相关的细胞通讯通路，识别与Prolif-like T细胞相关的细胞通讯途径。此外，使用Monocle方法进行伪时序分析，检查肿瘤细胞和Prolif-like T细胞发育过程中与Prolif-like T细胞相关的增殖标志物的表达变化。

使用CreateSeuratObject和Read10X_Image功能加载空间转录组数据（GSE253080），同时应用SCTransform功能进行数据标准化。为评估各种细胞特征，如增殖性T细胞特征、细胞周期活性、EMT特征和肿瘤细胞特征，采用了五种评分算法：Add、AUCell、UCell、ssGSEA和singscore。为最小化单个方法的潜在偏差，汇总所有五种算法的结果生成一个综合评分，称为Scoring，并将其视为真实特征评分。

本研究从TCGA、CGGA和GEO数据库获取了五个具有临床数据的GBM转录组队列。TCGA数据包括160名患者，CGGA数据包括216名患者（CGGA325、CGGA133），GEO数据集包括120名患者（GSE7695、GSE83300）。通过"sva"包合并五个数据集并去除批次效应，得到一个包含496个GBM样本的转录组矩阵，用于后续基因筛选和功能分析。

结果

使用RNA-seq和scRNA-seq筛选Prolif-like T细胞相关标志物

本研究整合了来自496名患者和149,002个细胞的大规模分析中的RNA-seq数据和scRNA-seq数据。对149,002个细胞进行单细胞聚类和注释，识别出52种细胞类型和12个细胞亚群。这12个细胞亚群包括TAN、内皮细胞、周细胞、单核细胞、少突胶质细胞、肿瘤细胞、巨噬细胞、增殖样肿瘤细胞、增殖样巨噬细胞、增殖样T细胞、T/NK细胞和B细胞。

研究发现增殖样T细胞不仅表达T细胞表面标志物（CD3D和CD3E），还高表达增殖相关标志物如TOP2A和MKI67。这些增殖标志物在增殖样肿瘤细胞和增殖样巨噬细胞中也上调表达，表明这些与增殖样T细胞相关的增殖标志物可能是GBM肿瘤组织的重要特征。

研究进一步识别出与增殖样T细胞相关的标志物，共2,261个基因。使用Log2FC > 0.585（倍数 > 1.5）的标准筛选，得到593个显著差异表达基因。基于转录组生存数据，单因素Cox回归分析识别出82个与GBM生存预后显著相关的关键基因，其中大多数是与GBM生存相关的高风险基因（HR > 1）。

研究使用GSVA包中的ssGSEA方法对GBM转录组中82个基因的表达进行通路富集评分，该评分反映了GBM患者中增殖样T细胞的富集程度。基于KM生存分析自动确定最佳截断值，发现高评分组患者（325例）的生存预后显著差于低评分组患者（171例），表明增殖样T细胞富集增加是GBM患者不良预后的指标。

与Prolif-like T细胞相关的GBM亚型和免疫微环境差异

研究基于82个关键基因的表达进行一致性聚类，将496名GBM患者分为C1和C2两类。使用ssGSEA分析和Hallmark通路集分析两类中常见通路的富集水平，结果显示与C2相比，C1表现出增殖通路的富集增加（如KRAS通路、AKT通路和Hedgehog通路）。KM生存分析显示，与C2相比，C1的生存时间更短，预后更差。药物敏感性分析显示，C1对5-氟尿嘧啶比C2更敏感，而C2对吉非替尼比C1更敏感。总之，C1比C2表现出更活跃的增殖活性，代表了一种更具恶性的GBM亚型。

使用多种免疫浸润分析评估两种亚型的免疫微环境。ESTIMATE分析显示，与C2相比，C1具有更高的基质评分、免疫评分和ESTIMATE评分，同时肿瘤纯度较低，表明C1具有更丰富的免疫微环境。然而，与C2相比，C1表现出显著更高的免疫抑制分子（如PD-L1和LAG3）表达，表明C1具有更明显的免疫抑制性免疫微环境。

基于TIMER数据库的在线分析，应用多种免疫浸润方法（如TIMER、CIBERSORT、EPIC、QUANTISEQ、MCPCOUNTER和XCELL）分析两种亚型的免疫细胞浸润。结果显示，与C2相比，C1具有更多的免疫细胞浸润，特别是在多个T细胞亚群中。由于本研究基于82个与增殖样T细胞相关的标志物对肿瘤进行分类，C1亚型可被视为具有较高免疫细胞浸润的亚型。然而，这并不一定意味着C1亚型具有活跃的抗肿瘤免疫应答。相反，基于现有结果，C1亚型表现出更明显的免疫抑制，这可能是因为免疫微环境中免疫细胞数量增加促进了肿瘤生长。

GBM生存预后模型的重要关键基因筛选

研究进一步从82个与增殖样T细胞相关的标志物中筛选代表性关键基因，利用GBM患者的临床生存数据构建生存预测模型。首先通过Lasso分析和训练集数据对基因进行初步筛选，随后通过多因素Cox回归分析识别出三个具有生存预测价值的基因（TK1、SP100和RPSA），并构建了生存模型和风险评分。其中TK1表现出高度显著的高风险特征（HR = 1.37, p < 0.001）。

训练集的生存曲线显示，高风险评分患者预后较差（p = 1.209946e-05）。ROC分析显示AUC值为0.842，证实了生存模型良好的预测性能。使用三个测试集（test1-3）验证生存模型，结果显示test1的生存曲线表明高风险评分患者预后较差（p=3.594277e-02），ROC分析显示AUC值为0.654。test2的生存曲线显示高风险评分患者预后较差（p=6.120802e-06），ROC分析显示AUC值为0.74。test3生存曲线显示高风险评分患者预后较差（p = 2.480428e-02），ROC分析显示AUC值为0.636。总之，所有测试集均证明生存模型具有良好的预测性能（p < 0.05, AUC > 0.6）。

研究进一步分析这三个基因在12个亚群中的表达，结果显示只有TK1在增殖样肿瘤细胞、增殖样巨噬细胞和增殖样T细胞中表达显著升高。因此，TK1是GBM肿瘤微环境中重要的增殖标志物，具有一定的研究价值。

TK1在GBM免疫微环境中的功能作用

使用BEST在线工具进一步分析TK1在GBM肿瘤中的表达及其对预后的影响。在大量GBM队列中，与正常组织相比，TK1在肿瘤组织中表达更高。在多个GBM生存队列中，TK1表达较高的患者往往预后较差。基于TCGA泛癌队列分析发现，TK1在多种肿瘤中表现出SNV突变和mRNA表达增加。

值得注意的是，在scRNA-seq数据中，TK1在增殖样肿瘤细胞和肿瘤细胞中的表达并不特别高，而主要在增殖样巨噬细胞和增殖样T细胞中表达。对scRNA-seq数据进行细胞通讯分析发现，增殖样肿瘤细胞和增殖样巨噬细胞与增殖样T细胞表现出增加的细胞通讯。增殖样T细胞主要通过SPF1、MIF和趋化因子相关信号通路与其他细胞群体进行通讯。增殖样肿瘤细胞和增殖样巨噬细胞可以通过多种通路与增殖样T细胞进行通讯，表明增殖样肿瘤细胞、增殖样巨噬细胞和增殖样T细胞这三个亚群表现出广泛的通讯。

此外，增殖样肿瘤细胞和增殖样巨噬细胞可以通过细胞通讯抑制T细胞活化，并进一步促进T细胞的促炎作用。基于scRNA-seq数据对增殖样T细胞和肿瘤细胞进行伪时序分析，分析82个标志物基因在两个细胞群体发育过程中的表达。结果显示，大多数基因在增殖样T细胞中的表达在早期增加，在晚期减少。相比之下，肿瘤细胞中基因的表达在早期减少，在晚期增加。TK1在两个亚群中也表现出类似的变化，但在增殖样T细胞中的表达变化更为平缓，而肿瘤细胞在晚期表现出TK1表达的突然增加。

基于这些发现，有理由认为肿瘤细胞（可能包括增殖样肿瘤细胞）可能通过TK1与增殖样T细胞存在潜在通讯。更具体地说，增殖样T细胞中的TK1通过某种途径进入肿瘤，促进肿瘤向增殖样肿瘤转化并加速肿瘤生长。因此，抑制肿瘤和肿瘤微环境中的TK1表达是治疗GBM的潜在治疗策略。

靶向TK1对GBM细胞的影响

使用BEST在线工具发现，GBM中TK1的表达与多个增殖标志物基因相关。PCNA表达与TK1表达显著相关（R = 0.46, p = 7.1e-10），MKI67表达与TK1表达显著相关（R = 0.55, p = 3.5e-14），MCM2表达与TK1表达显著相关（R = 0.5, p = 9.3e-12）。基于Hallmark通路的通路分析显示，TK1影响细胞周期通路和上皮间质转化（EMT）通路的富集水平。进一步的GSEA分析证实这两个通路是TK1的重要下游通路。

目前临床实践中尚无有效的TK1靶向抑制剂，因此本研究使用siRNA干扰GBM细胞系中TK1的表达以模拟治疗过程。主要使用两种GBM细胞系U251和U87，采用siRNA方法构建si-TK1细胞模型。CCK8实验结果显示，在24小时、48小时和72小时，抑制TK1表达降低了两种GBM细胞系的增殖能力。细胞划痕实验结果显示，抑制TK1表达缩短了两种GBM细胞系的迁移距离。Transwell侵袭实验结果表明，抑制TK1表达抑制了两种GBM细胞系的侵袭能力。

为进一步研究TK1抑制对细胞周期和EMT的影响，分析了si-TK1处理的U251细胞系中相关蛋白的表达。结果显示，抑制TK1表达显著 suppressed CCNA1（cyclin A1）和CCNB1（cyclin B1）的表达，且在GBM生存队列中CCNA1和CCNB1的高表达与较差预后相关。此外，抑制TK1表达显著 suppressed CDH2（N-Cadherin）和VIM（Vimentin）的表达，且在GBM生存队列中CDH2和VIM的高表达与较差预后相关。总之，靶向抑制TK1抑制了GBM的细胞周期和EMT过程，表明TK1是GBM中潜在的抗肿瘤靶点。

空间转录组分析强调增殖性T细胞、肿瘤细胞、EMT信号和细胞周期信号之间的紧密互连

空间转录组分析从另一个维度进一步强调了增殖性T细胞、肿瘤细胞和增殖性肿瘤细胞的存在以及它们之间的连接。有趣的是，观察到增殖性T细胞常出现在肿瘤细胞附近，特别是增殖性肿瘤细胞周围。在这些空间区域中，还检测到异常活跃的细胞周期和EMT信号。值得注意的是，TK1的空间表达模式密切反映了增殖性T细胞和肿瘤细胞的分布。更重要的是，TK1的空间特征与EMT信号和细胞周期信号具有相似的空间分布。总之，空间转录组进一步证实了增殖性T细胞在GBM中的重要作用，以及TK1对细胞周期信号和EMT信号的调控能力。

讨论

高级别胶质瘤是恶性胶质瘤的总称，指世界卫生组织（WHO）中枢神经系统肿瘤分类中的III级和IV级胶质瘤。GBM是HGG中最常见且最具侵袭性的亚型，属于IV级胶质瘤。GBM是HGG中预后最差的亚组，具有高复发率和高耐药性的特点。免疫疗法是GBM的一种潜在治疗方法，克服GBM肿瘤微环境的抑制作用是未来GBM治疗的一个潜在方向。本研究发现GBM的免疫微环境中存在大量增殖样T细胞，这些细胞与GBM肿瘤细胞高度相关。一些与增殖样T细胞相关的标志物是影响GBM不良预后的潜在因素。本研究通过多种生物信息学方法将TK1确定为与增殖样T细胞相关的重要标志物，它可以影响GBM细胞的细胞周期和EMT过程，是GBM的潜在治疗靶点。

TK1是一种重要的胞质酶，参与DNA合成和修复，主要催化胸苷磷酸化为胸苷一磷酸（dTMP），这是DNA前体分子合成中的关键限速步骤。其活性和表达水平在细胞周期的S期和G2期达到峰值，与细胞增殖状态密切相关。这一特性使其成为评估细胞增殖活性的重要分子标志物。在生理条件下，TK1活性主要存在于具有活跃增殖的组织中，如骨髓、淋巴组织、肠黏膜和生殖细胞。然而，在病理条件下，特别是在恶性肿瘤中，由于肿瘤细胞不受控制的增殖，TK1被大量合成并释放到血液中，导致血清TK1活性或浓度显著增加。这一现象已在各种实体瘤和血液恶性肿瘤中得到广泛证实。因此，血清TK1检测作为一种非侵入性液体活检方法，在肿瘤的早期筛查、辅助诊断、疗效监测、预后评估和复发风险预测方面显示出重要价值。本研究发现TK1在GBM肿瘤组织中的高表达也是肿瘤不良预后的重要指标。

TK1是DNA核苷酸补救合成途径中的关键酶，与细胞周期密切相关。在正常细胞中，TK1活性表现出严格的细胞周期依赖性，主要在S期表达，并在细胞分裂后迅速降解，血清中水平极低。然而，在恶性肿瘤中，这种精确调控被显著破坏。肿瘤细胞的异常增殖特性导致大量细胞进入S期并维持TK1的高表达；同时，肿瘤组织中细胞凋亡、坏死和肿瘤血管通透性的增加共同促进TK1蛋白或其片段大量释放到血液中，使其成为反映肿瘤细胞异常增殖活性的重要血清标志物。其过表达不仅与细胞周期调控因子的失调有关，还涉及多个肿瘤相关信号通路的异常激活和表观遗传修饰的改变。

最近的研究越来越多地揭示，TK1不仅是肿瘤细胞增殖的标志物，还是积极参与塑造免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的关键因素，通过多种机制影响TME的组成和功能状态。TK1在肿瘤细胞中的高表达加速了dTTP合成，直接满足快速增殖的DNA合成需求，从而促进肿瘤生长和侵袭。值得注意的是，肿瘤细胞可以通过外泌体途径将TK1蛋白或其活性形式释放到TME中。这些外泌体TK1（exTK1）分子被肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、MDSCs和树突状细胞（DCs）等免疫细胞摄取，显著破坏其正常免疫功能。例如，exTK1可以抑制T细胞活化和增殖，诱导T细胞凋亡或衰竭，促进TAMs向免疫抑制性M2表型极化，并增强MDSCs的免疫抑制活性，共同导致效应T细胞功能受损，并创造有利于肿瘤逃逸的免疫抑制环境。TK1可能通过影响关键代谢物水平或通过直接信号转导激活促炎和促生存通路，如NF-κB和STAT3。这些通路不仅进一步促进肿瘤细胞增殖、存活和侵袭，还持续刺激TME中免疫抑制性细胞因子的产生以及抑制性免疫细胞的招募和激活，形成维持免疫抑制和促肿瘤炎症的正反馈循环。此外，在大多数癌症中，TK1表达与肿瘤浸润淋巴细胞、免疫亚型和免疫调控因子相关。总之，TK1在肿瘤中的作用超越了简单的细胞增殖标志物。它通过促进肿瘤细胞自身增殖、介导外泌体依赖性免疫抑制和驱动促肿瘤炎症信号通路，深入而广泛地参与塑造免疫抑制性和促肿瘤的TME。因此，靶向TK1或其介导的信号通路（如开发TK1抑制剂或靶向携带TK1的外泌体）不仅旨在抑制肿瘤细胞增殖本身，还具有重塑TME、逆转免疫抑制和增强抗肿瘤免疫应答的潜力。本研究发现TK1在GBM的肿瘤微环境中也起着重要作用，作为与增殖样T细胞相关的重要标志物，其表达不仅在增殖样T细胞中升高，在增殖样肿瘤细胞中也升高。此外，TK1在GBM肿瘤组织中的高表达是肿瘤不良预后的指标，也是肿瘤进展的潜在特征。我们的研究还发现，单细胞数据中的肿瘤细胞簇并未表现出TK1的高表达。因此，基于多重分析结果和先前的研究，我们推测肿瘤细胞和增殖样T细胞之间存在TK1通讯，这有助于肿瘤细胞的进一步增殖和进展。因此，本研究将靶向TK1（细胞内和细胞外都是潜在靶点）确定为治疗GBM的潜在治疗策略。然而，目前尚无可用的TK1抑制剂。开发TK1抑制剂和特异性治疗途径仍然是一个重要的研究方向。虽然我们的研究为TK1在GBM中的研究提供了基础，但需要进一步的机制研究来阐明GBM中肿瘤细胞和增殖样T细胞之间的TK1通讯。

结论

总之，增殖样T细胞的高浸润与GBM的不良预后密切相关。TK1作为其主要标志物之一，可以促进GBM的增殖、迁移和侵袭。靶向TK1可能为GBM患者带来新的希望。