全球头孢他啶-阿维巴坦耐药肺炎克雷伯菌的流行病学特征与耐药突变机制研究

本综述系统解析了全球CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌的分子流行病学特征，揭示了外膜孔蛋白（OmpK35/OmpK36）、外排泵（AcrA/AcrB）突变与金属β-内酰胺酶（MBLs）、KPC变异体（如blaKPC-2/blaKPC-3）共存的多重耐药机制，为临床耐药防控和抗生素合理使用提供关键理论依据。

　　

引言

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）作为常见的革兰阴性机会性病原体，可引起呼吸道、泌尿道和血流等多部位感染，导致肺炎、尿路感染和菌血症等一系列疾病。根据2023年中国抗菌药物耐药监测系统（CARSS）数据，肺炎克雷伯菌在临床革兰阴性菌中的检出率达到22.8%，仅次于大肠埃希菌（28.3%）。中国碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（CRKP）的平均检出率为10.8%，不同省份的检出率在0.6%至26.2%之间波动。CRKP感染的流行在中国呈上升趋势，而多粘菌素和替加环素等最后一线药物的治疗因耐药性、不利的药代动力学和高毒性率而受到限制。CRKP感染的有效治疗策略有限，导致感染患者预后差，死亡率高。

头孢他啶-阿维巴坦（CAZ/AVI）作为一种β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合制剂，于2015年获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，并于2019年在中国投入使用。头孢他啶是一种第三代头孢菌素，通过阻断肽聚糖的交联来抑制细菌细胞壁合成，从而发挥抗菌活性。阿维巴坦（AVI）本身没有抗菌活性，但对肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）高度稳定。当与头孢他啶等广谱头孢菌素联合使用时，可保护头孢他啶免受KPC酶的水解，从而恢复头孢他啶的抗菌活性。尽管CAZ/AVI是治疗多重耐药（MDR）革兰阴性菌感染的一种有前景的药物，且临床使用时间较短，但临床CAZ/AVI耐药CRKP感染的报道已经出现。

因此，迫切需要在全基因组水平阐明CAZ/AVI耐药CRKP的基因组特征。本研究收集了来自既往文献、病原系统资源整合中心（PATRIC）以及本课题组的CAZ/AVI耐药CRKP菌株的全基因组序列数据，通过重新分析和总结全球CAZ/AVI耐药CRKP菌株的分子特征，旨在描述其流行病学特征，总结已知的耐药相关突变，并发现潜在的新耐药相关突变，为优化临床治疗方案提供有价值的参考。

材料与方法

本研究在解放军总医院第五医学中心、第七医学中心以及北京航天总医院展开，这些均为集医疗、教学、科研和预防为一体的三级甲等医院。菌株采集自临床和医院污水样本。临床肺炎克雷伯菌菌株采集自解放军总医院第七医学中心和北京航天总医院，污水样本采集自解放军总医院第五医学中心。临床菌株的纳入标准包括：1）从尿液、血液、痰液、支气管肺泡灌洗液（BALF）、粪便和腹水等各种临床样本中收集的菌株；2）经培养鉴定为肺炎克雷伯菌；3）感染为肺炎克雷伯菌的单一微生物感染。同一患者不同感染部位分离的菌株符合纳入标准。排除标准为：1）同一患者同一部位的重复分离株，仅选择两周内的首次分离株；2）多微生物感染；3）临床信息不完整的分离株。从2024年7月开始，每周一使用500 mL无菌水采样袋采集污水样本，样本采集持续2个月，共获得8份样本。

菌株在含有CAZ/AVI的选择性麦康凯琼脂平板上培养，并通过VITEK 2系统（BioMérieux）进行鉴定。使用大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853作为质控菌株。采用E-test方法评估对CAZ/AVI的敏感性，以肺炎克雷伯菌ATCC700603作为质控菌株。分别从临床和医院污水样本中分离出37株和11株CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌。鉴定出的CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌菌株保存在40%无菌甘油溶液中，于-80°C保存以供后续研究。此外，本研究还纳入了本课题组先前收集的236株CAZ/AVI敏感（CAZ/AVI-S）肺炎克雷伯菌菌株。

根据说明书，使用革兰阴性菌抗菌药物敏感性试验（AST）卡（VITEK 2 AST-GN13）进行AST。使用大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853作为质控菌株。测试的17种抗生素包括氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑林、头孢替坦、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南、厄他培南、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、呋喃妥因和甲氧苄啶/磺胺甲噁唑。AST结果解读遵循临床和实验室标准协会（CLSI）2023指南。CRKP定义为对碳青霉烯类抗生素（即亚胺培南、美罗培南、厄他培南；多利培南在中国不可用）中至少一种耐药的肺炎克雷伯菌菌株。

使用细菌DNA提取试剂盒按照制造商说明提取基因组DNA。使用NEBNext? Ultra? DNA文库制备试剂盒在Illumina NovaSeq 6000平台上进行测序。

从PubMed和病原系统资源整合中心（PATRIC）数据库检索CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌菌株的基因组序列。检索策略为：((((Ceftazidime-Avibactam) OR (CZA)) OR (CAZ/AVI)) AND (Klebsiella pneumoniae)) AND (genome)。在PubMed中共检索到157篇相关文章（截至2024年3月20日）。从这些文章中提取CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌菌株的完整基因组序列。从PATRIC数据库下载CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌菌株的完整基因组。提取每株菌的分离来源、宿主、采集日期和国家信息。

纳入标准如下：1）来自人类宿主的菌株；2）有完整的基本信息；3）经证实具有CAZ/AVI耐药表型的肺炎克雷伯菌。排除标准为：1）来自非人类宿主的菌株；2）基本信息不完整；3）无法确认CAZ/AVI耐药性；4）重复菌株；5）全基因组测序（WGS）数据不可用。应用这些标准后，保留了253个独特菌株。为了进一步研究CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌菌株在中国肺炎克雷伯菌菌株中的分布特征，我们还从NCBI GenBank（截至2024年6月7日）额外收集了976株来自中国的肺炎克雷伯菌的完整基因组。

使用Fastp v0.23.1和Shovill v1.0.0分别进行基因组序列的质量控制和组装。使用Centrifuge v1.0.3-beta对污染序列进行分类和去除。使用Quast v5.2.0评估基因组组装质量。使用CheckM v1.2.2评估组装基因组的完整性和污染。使用Kleborate v2.2.0确定物种身份。

使用Kleborate v2.2.0鉴定序列类型（ST），计算毒力得分，并确定荚膜位点（KL）和LPS抗原（O）类型。使用Abricate v1.0.1（覆盖度60%，一致性90%）与Resfinder、毒力因子数据库（VFDB）和PlasmidFinder（更新于2024年8月29日）来鉴定抗菌素耐药基因（ARGs）、毒力因子和质粒。使用TBtools将结果可视化为热图。使用ISEScan v1.7.2.3鉴定和注释插入序列（ISs）。使用DBSCAN-SWA和MacSyFinder分别预测前噬菌体和分泌系统。

使用Prokka v1.14.6对细菌基因组进行注释。使用Roary v3.13.0识别核心基因组。使用IQ-TREE2 v2.2.2.7通过自动模型选择和1000次bootstrap重复构建最大似然（ML）树。使用FigTree v1.4.4和iTOL可视化系统发育树。

外排泵相关基因（AcrA和AcrB）和外膜孔蛋白（OmpK35和OmpK36）经常被报道与CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌相关。因此，我们使用Miniprot v0.13-r248将参考蛋白序列（acrA: WP_002892072.1; acrB: WP_002892069.1; OmpK35: CAA09665.1; OmpK36: ADG56549.1）与所有CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌菌株的基因组进行比对，以识别可能影响蛋白质结构和功能的突变。随后使用BioAider对突变进行可视化。

结果

48株CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌的药敏试验结果

本研究分别从临床患者和医院污水样本中分离出37株和11株CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌菌株。这些菌株的AST结果显示，对氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、头孢他啶和头孢曲松四种抗生素的耐药检出率均为100%。对哌拉西林/他唑巴坦、头孢替坦、头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、甲氧苄啶/磺胺甲噁唑和呋喃妥因的耐药检出率在64%至94%之间。对阿米卡星、妥布霉素、环丙沙星和左氧氟沙星的耐药检出率均低于60%，其中阿米卡星的最低检出率为16.67%。此外，97.92%的这些菌株被鉴定为CRKP。

CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌的一般特征

我们从PubMed的相关文章和PATRIC数据库中收集了总共253株符合纳入和排除标准的CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌菌株。此外，加上我们收集的48株CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌，最终共有301株菌用于进一步分析。使用301株CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌、236株CAZ/AVI敏感肺炎克雷伯菌和976株肺炎克雷伯菌的基因组序列构建了核心基因组系统发育树。这些301株CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌分散在多个进化枝中。

这301株菌从2003年到2024年分离，其中75.1%在2018年至2020年间分离。它们来自15个国家。意大利（41.9%）、中国（33.6%）、美国（8.3%）、西班牙（6.0%）和巴基斯坦（4.0%）是主要国家。菌株有10种分离来源，其中血液（33.9%）、呼吸道分泌物（11.6%）、尿液（11.3%）和粪便（8.3%）是最常见的样本类型。值得注意的是，呼吸道分泌物是中国的主要来源，尤其是在2021年期间。

CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌的基因型特征

总共301株菌中有43种序列类型（STs）和37种荚膜血清型。主要的STs是ST147（22.5%）、ST11（18.9%）、ST512（15.2%）、ST307（7.3%）和ST258（6.9%）。最常见的KL类型是KL64（35.5%）、KL107（23.9%）、KL102（7.3%）、KL10（4.6%）和KL47（4.3%）。O抗原血清型主要为O1、O2、O3、O4和O5，其中O2最为普遍，占69.7%（210/301）。

CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌基因组中的可移动遗传元件

本研究共注释了27种质粒类型，包括10种产大肠杆菌素质粒、14种不相容群质粒和其他质粒（repB、repB (R1701)和pKP1433）。在所有菌株中，35株CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌分离株不携带任何质粒，而其余266株菌携带数量不等的质粒（每株1至9个）。检测到22种不同的插入序列（ISs），包括IS1、IS3、IS4、IS5、IS6、IS21、IS30、IS66、IS91、IS110、IS200/IS605、IS256、IS481、IS630、IS982、IS1182、IS1380、ISAS1、ISKRA4、ISL3、ISNCY和几个新的ISs。最普遍的ISs是IS3、IS5、IS21和ISNCY。新的ISs存在于46株CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌分离株中。对于我们团队收集的48株CAZ/AVI耐药菌株，预测的ISs数量在5到12之间。在301株菌中，在223株菌中预测到1692个前噬菌体。其中，106株携带前噬菌体的菌株注释有38种类型的ARGs。这些ARGs主要赋予对氨基糖苷类、β-内酰胺类、氯霉素、甲氧苄啶、磷霉素、大环内酯类、氟喹诺酮类、磺胺甲噁唑和四环素类的耐药性。

毒力基因和大分子分泌系统的特征

共注释了135种不同类型的毒力基因，每株菌携带49至132个。这些毒力基因与调节、抗菌活性/竞争优势、免疫调节、粘附、侵袭、生物膜、外毒素、效应物递送系统以及营养/代谢因子相关。所有菌株总共包含10种大分子分泌系统，包括I型分泌系统（T1SS）、II型分泌系统（T2SS）、IVa型菌毛（T4aP）、IVb型菌毛（T4bP）、V型分泌系统（T5aSS、T5bSS和T5cSS）、VI型分泌系统（T6SSi）和IV型分泌系统（pT4SSt和pT4SSi）。

CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌的耐药相关突变

对301株菌共注释了128个ARGs。我们特别关注了几个与肺炎克雷伯菌CAZ/AVI耐药突变相关的ARGs。我们发现，在301株菌中，B类金属β-内酰胺酶（MBLs）基因主要包括bla_IMP-4、bla_NDM-1、bla_NDM-5和bla_NDM-7；bla_KPC-2和bla_KPC-3变异体包括bla_KPC-8、bla_KPC-25、bla_KPC-29、bla_KPC-31、bla_KPC-32、bla_KPC-33、bla_KPC-34、bla_KPC-39和bla_KPC-41。孔蛋白和外排泵突变位点的计数如图所示。我们团队收集的48株CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌的大部分突变位点与公共数据库中253株CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌的突变位点相同。来自三个收集来源的301株CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌的OmpK35中最常见的替换是第28位（*aaK）。我们从临床样本中收集的13株CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌的OmpK35包含提前翻译终止密码子。OmpK36的突变数量最多，最常发生在第136位（T136G：苏氨酸被甘氨酸取代）、第137位（-gacacc）和第349位（H349R：组氨酸被精氨酸取代）。一些突变仅在我们团队从医院临床样本中分离的菌株中发现。在OmpK35孔蛋白中，第132位的谷氨酸被赖氨酸取代（E132K）。OmpK36孔蛋白的第2、3和146位分别从赖氨酸变为丝氨酸（K2S）、缬氨酸变为亮氨酸（V3L）和精氨酸变为组氨酸（R146H）。AcrA和AcrB的突变较少，均为替换。在AcrA的第188位，苏氨酸被丙氨酸取代（T188A）。在AcrB的第716位，精氨酸被亮氨酸取代（R716L）。

基于301株CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌核心基因组序列的系统发育树根据孔蛋白、ARGs、毒力得分和质粒大致分为十个进化枝。进化枝1中的菌株主要特征为孔蛋白突变和/或携带bla_KPC。进化枝2中的菌株主要特征为孔蛋白和外排泵突变。具有孔蛋白突变、外排泵突变和携带MBLs基因的菌株分布在进化枝2-8和进化枝10中。进化枝9中的菌株主要具有孔蛋白、外排泵和/或bla_KPC的变化。

在301株菌中，孔蛋白突变、外排泵突变和携带MBLs基因共存的比例最高。在公共数据库和我们的收集中，由MBLs产生引起的CAZ/AVI耐药菌株的比例存在显著差异（χ2 = 27.234, P < 0.001）。此外，我们总结了我们研究小组收集的48株CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌的耐药相关突变。两株菌（KPN522和KPN636）携带四个ARGs（bla_CTX-M-15、bla_OXA-1、bla_SHV-187和bla_TEM-1B），但没有我们密切监测的四种耐药相关突变中的任何一种。

301株CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌10个进化枝特征总结

来自意大利的126株菌分布在七个进化枝中，主要在进化枝1（43/70, 61.4%）和进化枝7（60/60, 100%）。它们的STs包括ST147（60株）、ST512（38株）、ST1519（3株）和ST258（2株）。47株菌和56株菌分别以KL107/O2和KL64/O2为典型。大多数菌株携带ARGs，主要包括bla_NDM-1（57株）、bla_CTX-M-15（60株）、bla_OXA-9（72株）和bla_OXA-1（53株）。所有菌株的OmpK35均有突变。来自中国的101株菌分布在七个进化枝中。进化枝2中的所有51株菌均采集自中国，每株菌都表现出OmpK35和OmpK36的突变。它们大多是ST11-KL64-O2（66.7%）和ST11-KL47（23.5%）。所有菌株的毒力得分均大于0，66.7%的菌株毒力得分为4。进化枝2中86.3%的菌株携带质粒，主要包括IncFII（43株）、ColRNAI（40株）和IncR（38株）。在来自美国的24株菌中，21株位于进化枝1。它们大多是ST258-KL107-O2菌株（13株）并携带bla_OXA-9（19株）。这24株菌中存在的质粒主要是IncFII（14株）和repB (R1701)（14株）。所有24株菌的OmpK35均有突变。此外，有三株菌未包含在任何进化枝中。

讨论

CRKP是对人类健康构成严重威胁的最关键病原体之一。它于2017年2月被世界卫生组织列为急需新抗生素的病原体。CAZ/AVI作为一种重要的治疗剂，在治疗CRKP感染方面发挥着重要作用。在本研究中，我们收集了来自三家医院的非重复临床和污水样本的肺炎克雷伯菌菌株基因组序列，以及来自既往文献和公共数据库的序列。目的是阐明CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌菌株的分子流行病学特征，并进一步确定对CAZ/AVI的耐药相关突变。

我们的研究表明，金属β-内酰胺酶（MBLs）是48株CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌菌株中主要的耐药相关突变。阿维巴坦是一种新型的非β-内酰胺类β-内酰胺酶抑制剂，通过酰化反应与β-内酰胺酶结合。它能有效抑制Ambler分类中的A类（如超广谱β-内酰胺酶，ESBLs；肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶，KPCs）、C类（如AmpC）和一些D类（如苯唑西林酶，OXAs）β-内酰胺酶，从而保护头孢他啶免受这些酶的水解。然而，阿维巴坦对MBLs（如新德里金属β-内酰胺酶，NDM、维罗纳整合子编码金属β-内酰胺酶，VIM；亚胺培南酶，IMP）没有抑制作用。因此，携带MBLs的肺炎克雷伯菌菌株对CAZ/AVI表现出天然耐药。

除MBLs外，bla_KPC-2和bla_KPC-3变异体是导致肺炎克雷伯菌对CAZ/AVI耐药的主要耐药相关突变之一。这些变异体主要增强对CAZ的水解活性或降低对AVI的亲和力。在我们的研究中，我们鉴定了几种变异体，包括bla_KPC-8、bla_KPC-25、bla_KPC-29、bla_KPC-31、bla_KPC-32、bla_KPC-33、bla_KPC-34、bla_KPC-39和bla_KPC-41。研究表明，无论是在bla_KPC-2还是bla_KPC-3中，最常见的突变是第179位氨基酸天冬氨酸（D）被酪氨酸（Y）取代，分别称为新KPC突变体bla_KPC-33和bla_KPC-31。这是最常报道的临床突变，也是在体外CAZ/AVI筛选条件下获得的最常见突变。KPC-3中第240位氨基酸缬氨酸变为甘氨酸（KPC-3的V240G替换）通常称为bla_KPC-8。bla_KPC-25（167_168dupLE）指的是KPC-2第167和168位亮氨酸和谷氨酸的重复。bla_KPC-39（A172T）指的是KPC-3第172位丙氨酸变为苏氨酸。bla_KPC-41指的是在bla_KPC-3第269和270位之间插入三个氨基酸（脯氨酸-天冬酰胺-赖氨酸，P-N-K）。总的来说，这些突变通常发生在A类β-内酰胺酶的Ω环中，该环是一个保守基序，包含KPC的Arg164至Asp179氨基酸残基。这些变异体可以降低菌株对CAZ/AVI的敏感性，它们的出现和传播对公共卫生构成威胁。因此，对肺炎克雷伯菌中这些KPC变异体的持续监测和研究至关重要。

研究表明，携带pAmpC、bla_OXA-1或（超）产抑制酶耐药bla_TEM变异体的肠杆菌科细菌，其出现大多报道于人类临床分离株，会损害β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂组合（如头孢洛扎烷-他唑巴坦和/或CAZ/AVI）的活性。因此，我们将进一步研究CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌菌株中bla_OXA-1和bla_TEM变异体的突变。

外膜孔蛋白和外排泵的改变构成对CAZ/AVI的耐药相关突变。在CAZ/AVI耐药细菌中，常见孔蛋白缺失、突变和表达减少。这些改变通过与其他耐药相关突变（如KPC酶中的突变）相互作用来增强耐药性。OmpK35和OmpK36是与CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌相关的最常报道的孔蛋白。在本研究中，我们发现CAZ/AVI耐药肺炎克雷伯菌中的OmpK35和OmpK36表现出不同程度的突变或缺失。先前的研究表明，蛋白质功能域内的突变会影响细菌耐药性。在我们的研究中，OmpK35（E132K）和OmpK36（K2S、V3L和R146H）的替换是在我们收集的菌株中发现的新突变。经过彻底审查，我们在既往文献中未找到相关报道。由于这些新突变位于蛋白质的功能域内，我们推测它们可能影响肺炎克雷伯菌菌株对CAZ/AVI的耐药性。如果在未来的临床分离株中检测到此类突变，则需要密切监测和适当用药。

耐药结节化细胞分裂（RND）外排泵AcrAB-TolC由周质融合蛋白AcrA、质膜转运蛋白AcrB和外膜通道蛋白TolC组成。它在革兰阴性菌的固有耐药和获得性耐药中起重要作用。与AcrB的参考序列相比，我们研究中AcrB最常见的变化是精氨酸（R）被亮氨酸（L）取代。一项研究报道，尼泊尔的阿奇霉素耐药伤寒沙门菌菌株不携带耐药基因，而是在acrB基因（STY0519）中有一个非同义突变，该突变将717密码子的精氨酸（R）变为亮氨酸（L）。该菌株的阿奇霉素耐药性是由acrB基因的染色体突变R717L介导的。这一发现突显了acrB基因在介导耐药性方面的潜在作用。此外，外排泵活性增加和某些基因的高表达可导致细菌对CAZ/AVI耐药。Nelson等人发现，ramR（AcrAB外排泵的调节因子）的突变可导致AcrAB-TolC外排系统的过度表达，并与孔蛋白改变共同促进对CAZ/AVI的耐药性。

有趣的是，我们从先前研究中收集的一株CA