前列腺癌跨源miRNA生物标志物的系统鉴定：计算与实验整合分析揭示miR-136-3p的诊断潜力

本研究通过整合计算分析与实验验证，系统筛选并验证了前列腺癌（PCa）中血清与组织共有的下调miRNA标志物。研究发现miR-136-3p在血清和组织中一致性低表达，且其靶基因富集于mTOR信号通路等癌症相关过程，为无创诊断PCa提供了新的潜在生物标志物。

　　

引言

前列腺癌（PCa）是全球男性中第二常见的恶性肿瘤，其早期诊断和有效治疗手段仍面临重大挑战。尤其是转移性PCa对现有疗法易产生耐药性，患者预后较差。近年来，microRNA（miRNA）作为内源性非编码RNA，在转录后水平调控基因表达，为癌症发病机制提供了新见解。研究表明，miRNA在PCa中常出现表达失调，可作为肿瘤抑制因子或癌基因发挥作用。然而，关于miRNA–mRNA调控网络在PCa中的作用研究仍较少。本研究旨在通过生物信息学方法结合实验验证，筛选PCa相关的关键miRNA，构建miRNA–mRNA网络，并探索其作为诊断生物标志物的潜力。

方法

MiRNA微阵列数据

研究使用了GEO数据库中的GSE112264数据集，包含809例PCa患者和282例对照组（包括241例阴性前列腺活检和41例非癌症样本）的血清miRNA数据。同时，从TCGA数据库下载了497例PCa组织和52例正常组织的miRNA数据。

PCa相关miRNA的鉴定

利用GEO2R和EdgeR工具分别分析GSE112264和TCGA数据集中的差异表达miRNA（DE-miRNA）。筛选标准为调整后p值小于0.05且|logFC|≥1。通过Venn图分析共同上调和下调的DE-miRNA。

DE-miRNA潜在靶基因预测

使用miRTarBase数据库预测共同DE-miRNA的靶基因，该数据库专门收集支持miRNA–mRNA相互作用的实验证据。

功能和通路富集分析

对筛选出的靶基因进行Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路富集分析，使用clusterProfiler包和DAVID数据库进行功能注释。p值小于0.05视为显著富集。

蛋白质-蛋白质相互作用网络构建与枢纽基因识别

利用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络， combined score≥0.4的节点对视为显著。使用Cytoscape软件的CytoHubba插件根据度数筛选前10个枢纽基因。

基于UALCAN数据库的靶基因表达分析

通过UALCAN数据库比较正常组织和PCa组织中与miR-146a-3p和miR-136-3p相关的 top 10基因的表达水平。

患者样本采集

从南华大学附属第一医院获取22例PCa患者和19例良性前列腺增生（BPH）患者的血清和组织样本。血清样本经离心处理后分装保存于-80°C。

RNA提取与qRT-PCR

使用TaKaRa试剂提取总RNA，并进行实时定量PCR（qRT-PCR）。miRNA表达水平以5S rRNA为内参，采用2^?ΔΔCt方法计算相对表达量。引物序列包括miR-136-3p和U6。

统计分析

使用双尾Student t检验比较两组间差异，Pearson相关分析血清与组织中miRNA表达的相关性。通过ROC曲线分析评估miRNA的诊断效能，计算AUC和95%置信区间（CI）。p值小于0.05视为显著。

结果

DE-miRNA与靶基因鉴定

从GSE112264数据集筛选出386个DE-miRNA（337个上调和49个下调），从TCGA数据集筛选出54个DE-miRNA（20个上调和34个下调）。Venn图分析显示，miR-146a-3p和miR-136-3p是共同下调的miRNA。通过miRTarBase预测出这两个miRNA的948个潜在靶基因。

功能富集分析

GO分析显示，靶基因显著富集于生物过程（BP）的转录和转录调控，细胞组分（CC）的细胞核和细胞质，以及分子功能（MF）的蛋白结合。KEGG通路分析表明，靶基因主要富集于卟啉和叶绿素代谢、mTOR信号通路和长期抑郁通路。

PPI网络构建与枢纽基因识别

PPI网络包含853个节点和3370条边。CytoHubba插件识别出前10个枢纽基因，其中miR-146a-3p的枢纽基因包括NSF、HIST2H2BE等，miR-136-3p的枢纽基因包括IGF2R、CADM1等。

UALCAN数据库中的枢纽基因表达

在PCa组织中，NSF和HIST2H2BE表达显著上调，而CD44、H1F1A等表达下调。对于miR-136-3p，IGF2R和CADM1在PCa组织中上调，NF1B、TGFB2等下调。这些上调基因可能受到miR-146a-3p和miR-136-3p的负调控。

GEO、TCGA和临床样本中miR-146a-3p和miR-136-3p表达的验证

公共数据库分析显示，miR-136-3p在血清和组织中均显著下调，而miR-146a-3p在组织中未显示一致下调趋势。ROC曲线分析表明，miR-136-3p在组织中具有较高的诊断价值（AUC=0.809），而miR-146a-3p的AUC较低（0.533）。临床样本qRT-PCR验证证实miR-136-3p在PCa血清和组织中均显著下调，且血清与组织表达呈正相关（R²=0.5251, p<0.0001）。miR-146a-3p在血清和组织中表达无显著相关性。

讨论

PCa的早期诊断至关重要，液体活检作为非侵入性方法，具有重要临床价值。本研究通过整合生物信息学分析和实验验证，发现miR-136-3p在PCa血清和组织中一致性低表达，且其靶基因富集于蛋白结合、mTOR信号通路等癌症相关过程。枢纽基因NSF、HIST2H2BE、IGF2R和CADM1在PCa中异常表达，可能参与肿瘤进展。miR-136-3p可能通过负调控这些基因影响PCa发展。然而，miR-146a-3p在血清和组织中的表达不一致，可能源于其多源性（如来自非肿瘤细胞或细胞外囊泡）或疾病阶段的动态变化。本研究局限性包括仅筛选出两个共同下调miRNA、枢纽基因度数较低、缺乏临床生存数据以及miR-146a-3p异质性机制未明。

结论

本研究证实miR-136-3p在PCa血清和组织中一致性低表达，具有作为PCa诊断生物标志物的潜力。通过构建miRNA–mRNA调控网络，为PCa的分子机制研究和无创诊断提供了新方向。