单细胞多组学解析糖尿病脂肪干细胞中c-Myb/AURKA介导的自噬与代谢重编程机制及其治疗潜力

本综述通过整合单细胞转录组学(scRNA-seq)与代谢组学技术，系统揭示了糖尿病(DM)微环境下脂肪干细胞(ADSCs)的功能异质性。研究发现高葡萄糖(HG)通过激活c-Myb/AURKA信号轴诱导保护性自噬，同时驱动代谢重编程向糖酵解倾斜，为糖尿病足溃疡(DFU)的干细胞治疗提供了新的靶向策略。

　　

背景：糖尿病(DM)会改变脂肪源性干细胞(ADSCs)的功能特性，导致糖尿病足溃疡(DFU)的组织修复受损，这是一种以慢性炎症为特征的病症。尽管多组学研究已经确定了DM中的代谢失调，但ADSCs功能障碍背后的转录和代谢网络仍然难以捉摸。本研究整合了单细胞转录组学和代谢分析，以表征DM相关的ADSCs亚群，并探讨了高葡萄糖(HG)诱导的炎症应激对自噬、凋亡和代谢重编程的影响。

方法：研究团队分析了来自三名DM患者和三名健康供体的ADSCs的单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据。使用Seurat进行亚群聚类，并通过富集分析进行功能注释。使用AUCell评分评估自噬、凋亡和代谢通路。使用HG处理的ADSCs进行实验验证，包括c-Myb/AURKA过表达/敲低、Co-IP、ChIP和双荧光素酶报告基因检测。

结果：研究人员鉴定出14个ADSCs亚群，其中C5 (TOP2A^High)、C8 (AURKA^High)、C9 (CCNB1^High)和C11 (MMP3^High)在DM中表现出G2/M期偏好以及增强的干性(C11)或增殖能力(C8)。HG通过c-Myb/AURKA通路诱导ADSCs自噬以抵抗凋亡。机制上，c-Myb直接结合AURKA启动子，而AURKA敲低消除了c-Myb诱导的自噬。在DM中，代谢重编程转向糖酵解/糖异生，尤其是在C8亚群中。

结论：该研究整合多组学数据证明，DM诱导了具有失调的细胞周期、干性、自噬、凋亡和代谢特征的独特ADSCs亚群。HG激活了ADSCs中c-Myb/AURKA介导的自噬，提示了在糖尿病炎症微环境中的潜在调控机制。上调c-Myb可能恢复ADSCs在DFU中的功能，为未来的个性化治疗奠定基础。

引言：基于脂肪源性干细胞(ADSCs)的治疗代表了再生医学各种应用中一种有前景的策略。受损的糖尿病伤口愈合是糖尿病的主要并发症，常常进展为慢性炎症性溃疡，并可能最终导致糖尿病足综合征，对肢体存活构成重大威胁。越来越多的证据表明，ADSCs通过调节胰岛素抵抗和高血糖、调节葡萄糖代谢、促进β细胞功能和再生以及作为基因递送载体来改善糖尿病(DM)。此外，ADSCs通过胶原沉积、抑制炎症和促进血管生成来加速糖尿病伤口愈合。然而，其临床转化仍然有限。

包括转录组学、蛋白质组学和代谢组学在内的高通量多组学技术能够发现新的疾病机制和治疗靶点。跨这些平台的数据整合对于破译复杂的生物系统和分子网络至关重要。尽管DM通过高血糖诱导的应激破坏干细胞功能，但ADSCs亚群对糖尿病微环境的异质性反应尚未完全了解。因此，我们结合单细胞转录组学和代谢分析来阐明糖尿病溃疡治疗的关键靶点。

转录因子c-Myb通过结合启动子区域来调节基因表达。在肿瘤中，c-Myb扩增诱导GRP78表达，促进细胞在缺氧和营养缺乏下的存活。c-Myb在斑马鱼造血过程中调节造血干细胞/祖细胞动员方面起着关键作用。它还参与调节成肌祖细胞的分化程序。此外，c-Myb通过诱导成骨基因和促进矿化基质产生，有助于长骨的成骨作用。同样， Aurora激酶A (AURKA)是一种对 mitosis 至关重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，可减轻糖尿病受损的缺血组织中的血管生成和氧化应激。研究进一步表明，来自人脐带华通胶来源的MSCs (WJ-MSCs)的AURKA调节骨骼肌细胞的抗凋亡作用，表明其对肌肉疾病（如杜氏肌营养不良症）具有治疗潜力。此外，低剂量抑制Aurora A可延长原发性纤毛的长度，恢复肥胖ADSCs的侵袭和迁移潜力，并改善其分化能力，突出了对抗肥胖相关代谢疾病的一种有前景的策略。然而，它们在HG下ADSCs功能障碍中的作用尚未被探索。

在此，我们采用scRNA-seq分析DM患者和健康对照者的ADSCs，揭示了14个不同的亚群，具有独特的细胞周期、代谢特征和干性——ADSCs自我更新和分化为多种细胞谱系的内在能力。我们进一步证实，HG通过c-Myb/AURKA轴诱导自噬，而c-Myb过表达赋予凋亡抗性。此外，HG使代谢转向糖酵解。我们的发现揭示了糖尿病ADSCs中亚群特异性的失调，并暗示c-Myb/AURKA是连接葡萄糖应激与ADSCs功能障碍的调控枢纽。

结果：

2.1 DM ADSCs的scRNA-seq分析

对ADSCs的ScRNA-seq数据(GSE229387)进行了分析，包括来自三名DM患者(Tag01, Tag03, Tag04)和三名健康供体(Tag02, Tag05, Tag06)的样本。经过质量控制和去除双联体后，保留了高质量细胞，并聚类成14个Seurat簇：C0 CEMIP^High ADSCs, C1 LTBP1^High ADSCs, C2 SERPINE2^High ADSCs, C3 ITGA11^High ADSCs, C4 MCMS^High ADSCs, C5 TOP2A^High ADSCs, C6 CXCL6^High ADSCs, C7 MFAP4^High ADSCs, C8 AURKA^High ADSCs, C9 CCNB1^High ADSCs, C10 DKK1^High ADSCs, C11 MMP3^High ADSCs, C12 GDF15^High ADSCs, 和 C13 AOX1^High ADSCs。

为健康供体(HD)和DM组以及不同细胞周期阶段的不同亚群生成了UMAP图。结果显示，C5 TOP2A^High ADSCs、C8 AURKA^High ADSCs、C9 CCNB1^High ADSCs和C11 MMP3^High ADSCs亚群主要处于G2M期。此外，通过计算Ro/e比率量化了每个DM ADSCs亚群在组间和细胞周期偏好中的分布。该分析证实，C5、C8、C9和C11 DM ADSCs亚群优先存在于G2M期。

为了进一步分析不同亚群在细胞周期和组间的比例，生成了比例条形图。结果显示，在所有处于G2M期的ADSCs亚群中，C8 AURKA^High ADSCs亚群的比例最高，其次是C9 CCNB1^High ADSCs，然后是C5 TOP2A^High ADSCs。亚群在组间的分布也各不相同，C12 GDF15^High ADSCs亚群在DM组中占76.2%，在HD组中占23.8%，而C11 MMP3^High ADSCs亚群在DM组中占79.6%，在HD组中占20.4%。

不同亚群的前五个基因表达显示在图中。

2.2 DM ADSCs亚群的干性特征和差异表达分析

图示了DM ADSCs亚群的分布。对干性相关基因表达谱的分析显示，CD44、CTNNB1、HIF1A和KDM5B在多个DM ADSCs亚群中高表达，表明它们广泛参与ADSCs干性的维持。

为了进一步评估干性特征，我们计算了不同DM ADSCs亚群、个体患者和组间的细胞干性AUC和G2M评分。C11 MMP3^High ADSCs亚群表现出最高的细胞干性AUC，表明其具有很强的干性潜力。在个体水平上，样本Tag03DM在所有样本中显示出最高的干性评分，并且DM组表现出比HD组更高的干性。

关于细胞周期活性，C8 AURKA^High ADSCs亚群具有最高的G2M评分，样本Tag01DM在所有样本中显示出最显著的G2M活性。总体而言，与HD组相比，DM组显示出更高的G2M评分，表明糖尿病状态可能增强特定ADSCs亚群的增殖活性。

差异表达分析进一步确定了在具有最高G2M评分的C8 AURKA^High ADSCs亚群中特征性上调的基因。这些基因包括FAM72D、ARHGEF39、ESPL1、MXD3和CDC25C。这些基因广泛参与细胞周期调节和干性维持，可能赋予该亚群在糖尿病微环境中独特的功能特性。

2.3 DM ADSCs亚群的生物学功能

为了研究DM患者中不同ADSCs亚群的生物学功能，我们对14个ADSCs亚群进行了富集分析。结果揭示了每个亚群独特的生物学特征和信号通路。

C0 CEMIP^High ADSCs与凝血和血管生成相关，涉及TGF-β和JAK-STAT通路，并在器官形态发生中发挥作用。C1 LTBP1^High ADSCs与肌肉和生长相关，参与排卵周期和补体级联反应，并与肌动蛋白丝解聚相关。C2 SERPINE2^High ADSCs与氧和反应过程相关，参与细胞质翻译和细胞外基质组织，并与核糖体功能有关。C3 ITGA11^High ADSCs与成骨细胞、细胞外基质组织和核糖体功能相关。C4 MCMS^High ADSCs与细胞周期相关，参与DNA复制，并与剪接体有关。C5 TOP2A^High ADSCs与有丝分裂相关，参与染色体分离，并调节染色体组织。C6 CXCL6^High ADSCs与白细胞相关，响应脂多糖，并与类风湿性关节炎和IL-17信号通路有关。C7 MFAP4^High ADSCs与白细胞、细胞外基质和结构组织以及细胞质翻译相关。C8 AURKA^High ADSCs与染色体相关，参与染色体分离，并调节有丝分裂核分裂。C9 CCNB1^High ADSCs与有丝分裂相关，参与染色体分离，并调节染色体组织。C10 DKK1^High ADSCs与定位相关，参与高尔基体囊泡运输和内吞作用。C11 MMP3^High ADSCs与有丝分裂相关，参与染色体分离，并调节染色体组织。C12 GDF15^High ADSCs与凋亡相关，参与细胞质翻译和核糖体功能。C13 AOX1^High ADSCs与抗原过程相关，参与氧化磷酸化，并参与T细胞介导的细胞毒性。

这些富集分析揭示了糖尿病相关ADSCs不同亚群的潜在功能，为糖尿病对ADSCs的影响提供了重要的生物学见解。

2.4 高葡萄糖差异调节ADSCs的自噬和凋亡

为了研究糖尿病条件下ADSCs自噬和凋亡的改变，我们首先基于scRNA-seq数据对每个亚群中自噬和凋亡相关基因的表达进行评分。与其他亚群相比，C5 TOP2A^High ADSCs、C8 AURKA^High ADSCs和C9 CCNB1^High ADSCs表现出较高的凋亡评分和相对较低的自噬评分。

为了进一步研究这些差异，我们应用AUCell算法来量化不同亚群以及DM和HD组之间的通路活性评分。凋亡评分在C8 AURKA^High ADSCs和C9 CCNB1^High ADSCs亚群中显著升高。此外，来自DM组织的ADSCs显示出比来自HD组织的ADSCs更高的总体凋亡评分，且具有统计学意义。

相比之下，大多数DM ADSCs亚群的自噬评分大致相似。值得注意的是，HD来源的ADSCs显示出比DM组织来源的ADSCs更高的总体自噬评分，这表明在糖尿病条件下，内源性ADSCs可能存在自噬损伤，这可能有助于糖尿病伤口不愈合。

为了研究高葡萄糖对外源性ADSCs的影响，将细胞暴露于高葡萄糖条件以模拟早期糖尿病微环境。定量分析表明，与对照组相比，高葡萄糖处理显著上调了自噬相关基因，包括LC3、ATG5、ATG7和BECLIN1。与转录变化一致，蛋白质印迹分析证实高葡萄糖促进了自噬活性，证据是Beclin1表达增加、LC3-I向LC3-II的转化增强以及24小时内p62的降解。此外，流式细胞术和蛋白质印迹显示高葡萄糖触发了ADSCs的凋亡。

总之，这些结果表明高葡萄糖应激同时诱导ADSCs的自噬和凋亡，并具有亚群特异性易感性。这种双重调节机制表明，糖尿病微环境可能通过协调激活自噬和凋亡通路来损害ADSCs功能。

2.5 高葡萄糖通过c-Myb上调增强ADSCs的自噬

免疫荧光分析证实了c-Myb在高葡萄糖处理的ADSCs中的核转位。与这一观察一致，c-Myb的mRNA和蛋白质水平在高葡萄糖条件下均显著升高。为了研究c-Myb对自噬的影响，我们调节了c-Myb的表达并评估了自噬活性。c-Myb过表达增强了自噬，而c-Myb敲低则消除了高葡萄糖诱导的ADSCs自噬相关蛋白的上调。这些发现证明c-Myb足以介导高葡萄糖诱导的ADSCs自噬激活。

2.6 c-Myb转录激活AURKA以介导ADSCs的自噬

转录组分析显示AURKA在DM ADSCs亚群中广泛表达，在C8亚群中富集最高。UMAP图和条形图分析进一步证实了AURKA在C5、C8、C9和C11亚群中的表达升高。值得注意的是，DM来源的ADSCs表现出比HD来源细胞显著更高的AURKA表达，特别是在Tag01和Tag03样本中，并且在G2/M期表达达到峰值，表明AURKA在ADSCs响应高葡萄糖应激中发挥作用。

为了阐明c-Myb在糖尿病条件下调节ADSCs自噬的分子机制，我们最初进行了靶点预测分析。ChIP-seq数据挖掘（Cistrome Data Browser: 50573）将AURKA鉴定为c-Myb的潜在直接转录靶点。随后的实验验证表明，高葡萄糖处理显著上调了ADSCs中AURKA的mRNA和蛋白质表达水平。进一步的机制研究表明，c-Myb过表达显著增强了AURKA蛋白表达。c-Myb敲低有效消除了高葡萄糖诱导的AURKA上调。Co-IP实验表明，c-Myb可以直接与AURKA相互作用。使用JASPAR (http://jaspar.genereg.net/)进行的生物信息学分析预测了AURKA启动子区域内特定的c-Myb结合位点。这一预测得到了实验验证。ChIP-qPCR followed by agarose gel electrophoresis demonstrated direct binding of c-Myb to the AURKA promoter。此外，比较野生型(AURKA-WT)和突变型(AURKA-MT，c-Myb结合位点被破坏)启动子构建体的荧光素酶报告基因检测显示，该突变完全消除了转录调节。总之，这些结果提供了确凿的证据，证明c-Myb直接转录调节AURKA表达。对c-Myb/AURKA轴的功能表征揭示了其在糖尿病条件下维持ADSCs稳态中的关键作用。AURKA的基因敲除不仅减弱了c-Myb介导的自噬相关蛋白的诱导，而且显著增加了ADSCs的凋亡细胞死亡。这些发现建立了一个机制联系，即c-Myb通过转录激活AURKA，协调了一个促进自噬流和增强细胞在高葡萄糖应激下存活的协调细胞反应。

2.7 ADSCs在糖尿病条件下表现出亚型特异性的代谢重编程

为了系统分析ADSCs在糖尿病微环境中的代谢特征，对不同的DM ADSCs亚群和来自不同组的样本进行了代谢通路评分。结果表明，氧化磷酸化和糖酵解/糖异生在大多数DM ADSCs亚群中评分很高，表明它们是ADSCs中的主要代谢途径。进一步比较发现，糖酵解/糖异生在DM组中显著升高，而氧化磷酸化在HD组中更活跃，表明糖尿病可能驱动ADSCs代谢转向糖酵解依赖。

在关键功能亚群C8 AURKA^High ADSCs中，通路分析显示前两个富集的通路是氧化磷酸化和糖酵解/糖异生，表明该亚群在糖尿病环境下具有显著的代谢活性。对不同亚群氧化磷酸化富集的进一步分析显示，C12 GDF15^High ADSCs和C13 AOX1^High ADSCs在该通路中表现出最高的富集，而C10 DKK1^High ADSCs和C11 MMP3^High ADSCs的评分最低。相比之下，糖酵解/糖异生在各个亚群中的分布更为平衡。

总体而言，这些结果突出了ADSCs在糖尿病微环境中潜在的代谢重编程趋势。其具体机制及其对细胞命运的影响值得进一步研究。

讨论：糖尿病伤口微环境以严重炎症、生物膜形成、过量活性氧(ROS)产生、缺氧和一氧化氮(NO)合成受损为特征，易导致慢性不愈合伤口。包括外周血管疾病和多种微生物感染在内的合并症进一步加剧了这种情况。目前的临床干预措施，如清创术、生长因子疗法和抗菌治疗，往往无法实现完全伤口愈合，强调了对新治疗靶点的需求。

ScRNA-seq彻底改变了我们对细胞异质性的理解，克服了批量组织分析的局限性。当与人工智能驱动的多组学平台整合时，该技术能够精确解码疾病特异性的免疫炎症网络，为个性化医疗铺平道路。先前的单细胞研究揭示了糖尿病足溃疡(DFU)病理生理学的前所未有的细节。对DFU信号通路的分析表明，包括IL-1、IL-16、LIGHT、CHEMERIN和IGF在内的细胞因子在非愈合伤口组织中特异性表达。对DFU患者伤口愈合中富集纤维母细胞的scRNA-seq显示，过表达MMP1、MMP3、MMP11、HIF1A、CHI3L1和TNFAIP6基因的纤维母细胞表现出促愈合功能。此外，干细胞通过招募巨噬细胞和内皮谱系细胞到缺血和损伤区域，作为伤口修复中必需的“种子细胞”，在那里它们通过分泌生长因子和建立促再生微环境来促进组织再生。我们的研究通过构建糖尿病ADSCs的综合单细胞图谱扩展了这一知识，识别出14个功能不同的亚群，具有改变的细胞周期分布和代谢偏好。值得注意的是，C5 TOP2A^High ADSCs、C8 AURKA^High ADSCs、C9 CCNB1^High ADSCs和C11 MMP3^High ADSCs亚群在糖尿病条件下显示出主要的G2M期积累，其中C8比例最高。包括FAM72D、ARHGEF39、ESPL1、MXD3和CDC25C在内的细胞周期调节因子可能维持干性并赋予糖尿病微环境独特的功能适应。功能富集分析揭示了糖尿病相关ADSCs不同亚群的潜在功能。在这些亚群中，C8 AURKA^High ADSCs与染色体相关，参与染色体分离，并调节有丝分裂核分裂。与