灰皮诺葡萄病毒（GPGV）运动蛋白与外壳蛋白功能比较分析：症状型与无症状型变异株的致病机制研究

本综述系统比较了灰皮诺葡萄病毒（GPGV）症状型与无症状型变异株的运动蛋白（MP）和外壳蛋白（CP）在RNA沉默抑制（VSR）活性及坏死诱导能力上的功能差异。研究发现，CP仅具局部VSR活性且无株系间显著差异，而MP虽无局部VSR活性，但表现出系统性VSR活性，且症状型MP诱导更强烈的坏死反应。研究通过磷酸化位点预测和蛋白结构分析，提出MP羧基末端的氨基酸变异（如Ser300/Phe300）及其潜在磷酸化模式可能通过影响蛋白互作参与症状发育，为GPGV致病机制提供了新见解。

　　

1 引言

灰皮诺葡萄病毒（GPGV）是乙型线性病毒科（Betaflexiviridae）毛病毒属（Trichovirus）成员，其感染与葡萄叶片斑驳畸形病（GLMD）相关。该病毒在全球葡萄栽培区广泛分布，且同时存在于症状和无症状植株中，其致病机制尚未明确。研究表明，病毒变异、宿主品种耐受性及RNA沉默抑制蛋白（VSR）功能差异可能与症状发育相关。GPGV基因组为正义单链RNA，包含三个开放阅读框（ORF）：ORF1编码复制相关蛋白，ORF2编码运动蛋白（MP），ORF3编码外壳蛋白（CP）。

2 材料与方法

本研究以本氏烟（Nicotiana benthamiana）转基因株系16c（稳定表达GFP）及野生型植株为实验材料，通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的瞬时表达系统分析蛋白功能。构建了源自匈牙利症状型（HUCSK9s）和无症状型（HUCSK8as）GPGV变异株的MP和CP表达载体，并以已知VSR蛋白（p19^CymRSV、2b^CMV、P0^BWYV）作为对照。通过GFP荧光强度量化、Western blot、RT-qPCR及小RNA Northern blot等技术评估局部与系统性VSR活性。坏死表型通过ImageJ软件量化分析，蛋白结构采用AlphaFold3预测，磷酸化位点通过NetPhos 3.1在线工具预测。

3 结果

3.1 CP与MP的序列比较

症状型与无症状型GPGV变异株的CP和MP序列高度保守（氨基酸同源性分别＞94.5%和＞98.6%），但MP羧基末端存在关键多态性位点。症状型MP因C/T多态性导致提前终止密码子，较无症状型短6个氨基酸。此外，症状型MP在297、300、301等位点存在特异性氨基酸变异（如Leu²⁹⁷/Pro²⁹⁷、Ser³⁰⁰/Phe³⁰⁰、Pro³⁰¹/Ser³⁰¹）。

3.2 CP的VSR活性分析

CP蛋白均表现出局部VSR活性，但无系统性VSR活性。Western blot与RT-qPCR结果显示，GFP蛋白及mRNA水平在CP表达条件下略有升高，但症状型与无症状型CP的VSR活性无统计学差异。miR168表达水平未受CP影响，表明其VSR机制不依赖AGO1调控通路。

3.3 MP的VSR与坏死诱导活性

MP未表现局部VSR活性，但具有微弱的系统性VSR活性。瞬时表达MP诱导本氏烟叶片坏死，且症状型MP（MPs）的坏死程度显著强于无症状型（MPas）。通过构建重组MP变异体（MPshort、MPmix）及测试天然变异体MP HU-27（具长MP但聚类于症状型 clade），发现坏死诱导能力与MP羧基末端序列密切相关。MPs在Ser³⁰⁰→Phe³⁰⁰及Pro³⁰¹→Ser³⁰¹位点的变异可能通过影响蛋白结构与磷酸化模式增强坏死表型。

3.4 蛋白结构与磷酸化预测

AlphaFold3结构预测显示，MP羧基末端区域（aa 294–306）构象稳定性较低，且症状型与无症状型MP在关键位点（如300、301）的氨基酸差异可能改变表面环区结构，影响蛋白互作。NetPhos预测表明，无症状型MP的Ser³⁰⁰为潜在磷酸化位点，而症状型MP的Phe³⁰⁰无此修饰可能，提示磷酸化状态差异可能参与功能调控。

4 讨论

本研究证实GPGV-CP具有局部VSR活性，但其在症状发育中的作用有限；而MP通过系统性VSR活性及坏死诱导能力参与宿主防御调控。症状型MP更强的坏死诱导能力与其羧基末端氨基酸变异（如Ser³⁰⁰/Phe³⁰⁰）及潜在磷酸化修饰相关，这些变异可能影响MP与宿主因子的互作效率。尽管本研究在模式植物中揭示了MP的功能差异，但其在葡萄中的具体致病机制仍需通过感染性克隆进一步验证。此外，病毒滴度、宿主品种耐受性及环境因素（如硼缺乏）也可能协同影响GLMD症状表现。