氟唑菌酰胺特异性结合 Fusarium fujikuroi ATP 合酶亚基 FfATPh 的分子机制与靶点鉴定研究

为解决氟唑菌酰胺（Fluazinam）作用机制不明确的问题，来自国内的研究人员通过原核表达纯化、微量热泳动（MST）及分子对接技术，发现Fluazinam特异性结合稻瘟病菌ATP合酶亚基FfATPh（Kd=25.34±11.?nM），关键位点为Asp42和Phe43，为药物优化提供了新靶点与理论依据。

　　

水稻恶苗病是一种由Fusarium fujikuroi（富士病菌）引起的毁灭性病害，目前主要依赖化学药剂进行防控。氟唑菌酰胺（Fluazinam）作为一种氧化磷酸化解偶联剂，已被登记用于该病的防治，但其具体作用机制仍不明确。

前期研究发现，富士病菌中ATP合酶（ATP synthase）亚基FfATPh、FfATP5和FfATPb的缺失突变体对氟唑菌酰胺的敏感性显著下降，提示这些亚基可能参与药物的作用过程。为进一步探究其机制，研究人员通过原核表达和镍柱亲和纯化技术，成功获得了FfATPh、FfATP5和FfATPb的重组蛋白（分别标记为His₉-MBP-TEV-ATPh、His₉-MBP-TEV-ATP5和His₉-MBP-TEV-ATPb）。

利用微量热泳动（MST, Microscale Thermophoresis）技术进行亲和力测定发现，氟唑菌酰胺与FfATPh的结合能力最强，解离常数K_d值为25.34?±?11.71?nM；而与FfATP5和FfATPb的K_d值分别为1.49?±?1.32?μM和1.04?±?0.75?μM，与阴性对照His₉-MBP-TEV的K_d值（2.57?±?2.02?μM）相近。这一结果明确表明，氟唑菌酰胺对FfATPh具有高度特异性亲和力。

分子对接分析进一步揭示，氟唑菌酰胺可与FfATPh的Asp42和Phe43残基形成氢键。为验证这些位点的重要性，研究团队构建了FfATPh的点突变蛋白（D42A、D42H、F43A、F43S），并进行了亲和力检测。结果显示，所有突变体的结合能力均出现不同程度下降，其中Asp42突变的影响尤为显著：D42A和D42H突变体的K_d值分别上升至639?±?431?nM和1.61?±?1.36?μM。

综上所述，氟唑菌酰胺通过特异性结合富士病菌ATP合酶亚基FfATPh发挥药效，其中Asp42是关键的结合位点。该研究不仅揭示了氟唑菌酰胺的作用新机制，也为后续药物结构优化和靶向杀菌剂设计提供了重要理论依据。