乙烯响应因子VvERF045整合乙烯、油菜素内酯和脱落酸通路调控葡萄花青素生物合成的机制研究

本研究发现葡萄乙烯响应转录因子VvERF045作为关键整合器，通过直接激活花青素合成基因（VvUFGT、VvDFR）、油菜素内酯（BR）合成基因（VvDWF4、VvCPD）和脱落酸（ABA）合成基因（VvZEP/ABA1）的启动子，并与R2R3-MYB转录因子VvMYB62形成异源二聚体协同增强转录活性，揭示了乙烯（ET）通过VvERF045介导的BR和ABA生物合成途径协同调控非跃变型果实花青素积累的分子机制，为精准农业中通过ETH处理改善葡萄着色提供了理论依据。

　　

引言

葡萄（Vitis vinifera L.）作为全球园艺产业的重要组成部分，其果实色泽主要由花青素类黄酮色素决定。花青素生物合成通过苯丙烷途径完成，该途径包含三个功能层次：苯丙烷核心（PAL、C4H、4CL）、黄酮骨架（CHS、CHI、F3H）和花青素特异性修饰（DFR、F3'H、LDOX、UFGT）。MBW复合物（MYB-bHLH-WD40）特别是R2R3-MYB转录因子（TFs）通过激活VvMYBA1/A2等基因调控这一代谢级联反应。

花青素积累受遗传程序和环境因素共同调控，其中植物激素特别是脱落酸（ABA）和油菜素内酯（BR）在非跃变型葡萄着色中起关键作用。ABA通过激活MYB TFs和抵消VvSBP8/13介导的MBW复合物组装抑制来促进花青素积累；BR与光感知协同激活"赤霞珠"葡萄中的花青素和原花青素生物合成，并通过BZR1依赖性转录激活直接上调VvMYBA2/PA1。虽然乙烯（ET）主要调控跃变型果实成熟，但功能性ET生物合成在葡萄浆果中持续存在并贡献于转色前发育。乙烯利（ETH）处理被广泛应用于加速葡萄着色，然而ET与ABA/BR途径在非跃变型果实着色中的分子整合机制仍不清楚。

结果

ETH处理协同增强花青素积累及内源BR和ABA生物合成

外源ETH处理显著增强了"瑞都红玉"葡萄从DAA 40到DAA 60的着色进程，同时提高了果实可溶性固形物（TSS）含量和花青素积累。ETH处理还提高了内源BR和ABA水平，并上调了花青素生物合成基因（VvDFR、VvUFGT）、BR生物合成基因（VvCPD）和ABA生物合成基因（VvZEP/ABA1）的表达。在"佳美"葡萄愈伤组织中，ETH处理同样促进了着色、花青素积累以及BR和ABA水平的提升。

ET诱导的VvERF045参与协调葡萄果实成熟期间花青素积累与BR/ABA稳态

转录组测序（RNA-Seq）分析发现ETH处理在不同发育阶段差异表达基因（DEGs）的动态变化。加权基因共表达网络分析（WGCNA）显示VvERF045作为枢纽基因与花青素和BR生物合成途径密切相关。系统发育分析将VvERF045分类为ERF亚组IV，其含有保守的AP2结构域和三个功能 motif。VvERF045在细胞核中定位，ETH激活其启动子活性并促进其蛋白快速积累。

VvERF045作为整合花青素生物合成与BR/ABA代谢网络的核心调控枢纽

通过葡萄浆果注射进行VvERF045瞬时过表达（OE）显著增强了着色，增加了花青素、BR和ABA的积累，并共激活了花青素生物合成（VvC4H、VvCHI、VvF3'H、VvDFR、VvUFGT）、BR生物合成（VvDWF4、VvCPD、VvDET2、VvROT3、VvBR6OX1）和ABA生物合成（VvZEP/ABA1、VvNCED2、VvAAO3.3）相关基因的表达，同时下调了BR catabolism（VvBAS1）和ABA catabolism（VvCYP707A1）基因。VvERF045沉默则产生相反效应。葡萄茎秆介导的农杆菌浸润和稳定转基因"佳美"愈伤组织实验进一步验证了VvERF045对花青素积累和BR/ABA代谢的协调调控作用。

在异源番茄系统中过表达VvERF045导致植株矮化、果实增大和可溶性固形物含量增加等BR介导的表型，同时在果皮、叶片和茎秆中观察到花青素沉积，伴随BR和ABA的组织特异性积累以及花青素（SlUFGT、SlDFR）、BR（SlDWF4、SlCPD）和ABA（SlZEP/ABA1）途径关键基因的保守上调。

VvERF045通过顺式作用模块调控直接激活花青素积累及BR/ABA生物合成

基因共表达网络分析显示VvERF045与花青素生物合成基因（如VvUFGT和VvDFR）呈强正相关。启动子结构分析在这些生物合成基因中鉴定出保守的顺式作用元件，包括脱水响应元件（DRE core，GCCGAC）和GCC-box（GCCGCC）。酵母单杂交（Y1H）实验证实VvERF045结合VvUFGT和VvDFR的启动子，截短启动子Y1H实验将相互作用定位于GCC-box（153 bp，VvUFGT）和DRE core（1454 bp，VvDFR）。电泳迁移率变动分析（EMSA）证实His-VvERF045与含有VvUFGT/VvDFR motif（GCCGCC/GCCGAC）的探针直接结合，竞争实验验证了相互作用的特异性。双荧光素酶（Dual-LUC）实验证实VvERF045介导对VvUFGT和VvDFR启动子的转录激活。

类似地，VvERF045也直接结合BR生物合成基因VvDWF4（ACCGAC）、VvCPD（GCCGAC）和ABA生物合成基因VvZEP/ABA1（TCCGAC）启动子中的DRE core motif，并通过Dual-LUC实验证实其对VvDWF4、VvCPD和VvZEP/ABA1启动子的显著转录激活作用。

VvERF045与R2R3-MYB激活因子VvMYB62协同互作

转录组分析鉴定出VvMYB62作为多个比较组中的DEG，这个ET诱导的R2R3-MYB转录因子具有果实特异性表达优势，与ABA生物合成途径强相关。VvMYB62在细胞核中定位，ET响应性启动子激活通过Dual-LUC实验验证。转基因验证显示VvMYB62在VvERF045-OE系统中一致上调，而在沉默对应体中显著抑制。

酵母双杂交（Y2H）筛选发现VvERF045与MYB家族成员特别是VvMYB62相互作用。双分子荧光互补（BiFC）在本氏烟中显示重构的YFP信号特异性定位于核区室。体内共免疫沉淀（Co-IP）证实天然细胞环境中稳定复合物形成，体外GST pull-down实验验证His-VvERF045与GST-VvMYB62的直接结合。分裂荧光素酶互补实验（Split-LUC）定性表征了这一相互作用的动力学。

异源二聚体VvERF045-VvMYB62协同增强花青素积累和植物激素生物合成

VvMYB62含有双SANT结构域，是R2R3-MYB TFs的典型特征。在"佳美"葡萄愈伤组织中瞬时过表达VvMYB62导致花青素生物合成基因（VvDFR、VvUFGT、VvANR）和苯丙烷途径组分（VvPAL1、Vv4CL、VvCHI、VvC4H）的协调上调，以及BR相关VvDWF4和ABA相关VvZEP/ABA1的显著诱导。组合Dual-LUC实验阐明了一个协同共激活机制：VvERF045-VvMYB62二元复合物显著增强花青素生物合成基因（VvDFR、VvUFGT）和植物激素途径生物合成组分（VvCPD、VvDWF4、VvZEP/ABA1）的转录激活。

VvERF045通过协调BR和ABA途径整合ET感知调控浆果着色

外源24-表油菜素内酯（EBL）和ABA在DAA 40处理协同增强了"穆斯卡特汉堡"葡萄从DAA 47到DAA 75的着色，EBL+ABA组合表现出显著协同增效作用。靶向代谢分析鉴定出锦葵素-3-O-糖苷、芍药素-3-O-糖苷、飞燕草素-3-O-糖苷、矢车菊素-3-O-糖苷和矮牵牛素-3-O-糖苷及其相应-3-O-芸香糖苷形式的协同上调。植物激素分析显示内源BR水平随着成熟进程逐步积累，而ABA水平在转色中期（DAA 55）达到峰值后下降。

发育时间过程分析（DAA 20-90）揭示了非跃变型葡萄中ET、ABA和BR的序贯激活，ET首先达到峰值（DAA 40），随后是ABA（DAA 60）和BR（DAA 80）。化学遗传扰动方法证实BR和ABA生物合成途径的靶向抑制（使用brassinazole (BRz)和fluridone）导致VvERF045-OE愈伤组织中表型减弱，色素沉着强度显著降低，花青素、BR和ABA含量全面抑制，VvERF045本身以及花青素生物合成（VvUFGT、VvDFR）、BR生物合成（VvDWF4、VvCPD）和ABA生产（VvZEP/ABA1）关键组分的显著下调。

转录动力学分析显示ETH处理后靶基因间存在时间有序的转录级联：VvERF045在诱导后1小时表达显著峰值，先于植物激素生物合成基因如VvCPD（2小时）、VvZEP/ABA1（2小时）和VvDWF4（3小时）的序贯激活，随后花青素生物合成关键基因包括VvDFR和VvUFGT在处理后7小时显著上调。相反，使用1-甲基环丙烯（1-MCP）抑制ET信号完全取消了ETH诱导的效应。

讨论

本研究阐明VvERF045作为核心协调器整合ET感知与ABA和BR生物合成，从而精确调控葡萄浆果着色。该机制框架通过四个关键见解显著推进了对非跃变型果实生物学的理解：首先，ET通过序贯激活以层级方式协调ABA和BR途径；第二，植物激素生物合成的阶段性诱导确保在花青素生物合成前有充足的前体供应；第三，VvERF045进化上将植物激素协调与果实品质性状调控相联系；最后，ETH外源处理可利用VvERF045调控网络精确调控花青素积累。

材料与方法

实验采用早熟品种"瑞都红玉"和晚熟品种"穆斯卡特汉堡"葡萄。"佳美"愈伤组织在B5培养基上23°C黑暗培养。外源ETH、ABA、EBL和处理方法如文中所述。转录组测序在OEbiotech进行，使用NanoDrop 2000和Agilent 2100 Bioanalyzer评估RNA完整性。DEGs基于严格标准（|log<2>FC| > 1，FDR < 0.05）识别。功能富集分析包括GO注释、KEGG通路作图和热图可视化。

使用RNA Prep Pure Plant Plus Kit提取总RNA，PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser进行cDNA合成，CFX Connect System进行qRT-PCR。所有载体使用ClonExpress II Kit构建。亚细胞定位、BiFC、Dual-LUC、Split-LUC、Y1H、Y2H、转录激活功能验证、EMSA、Co-IP和GST pull-down实验均按标准程序进行。

过表达植物通过农杆菌介导的转化构建，VIGS实验使用pTRV2-VvERF045质粒。ET发射测定采用气相色谱（GC）分析，ABA浓度通过高效液相色谱（HPLC）测定，BR浓度使用酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒定量。花青素含量采用pH示差法测定，花青素单体通过LC-MS/MS（QTRAP 6500）定量。

生物信息学分析使用TBtools进行层次聚类，WGCNA将RNA-Seq谱与代谢物含量关联，共表达网络在OE云平台构建。系统发育分析使用MEGA 5.0（ClustalW），motif分析使用MEME Suite，结构域表征使用SMART Suite，顺式元件通过PlantCARE预测。分子对接使用AlphaFold3预测结构并用PyMOL可视化。

数据代表三个生物学或技术重复，使用SPSS 16.0分析。数值表示为平均值±标准误（SE），显著性通过Student's t检验和ANOVA后的Duncan检验确定（p < 0.05, *p < 0.01）。使用GraphPad Prism 9.0和BioRender网站制作图表。

作者贡献

J.L.进行了大部分实验、数据分析和初稿撰写；Q.G.修改稿件并优化逻辑结构；Y.Q.负责样品制备和关键实验；R.h.Y.参与稿件修订；B.L.和Y.H.提供研究建议；B.H.、Y.Z.、J.H.和S.H.提供实验材料；D.G.、C.M.、S.t.J.和C.Z.审阅稿件；L.W.和S.W.监督研究并提供战略指导。

致谢

感谢河北省农林科学院昌黎果树研究所韩斌博士和广西农业科学院葡萄与葡萄酒研究所张瑛博士提供的宝贵建议和实验材料。

利益冲突

作者声明无利益冲突。