ZmMYB127通过整合淀粉、玉米醇溶蛋白与生长素合成通路调控玉米籽粒质地与大小的分子机制

本刊推荐：本研究通过全基因组关联分析（GWAS）和转基因功能验证，首次鉴定出胚乳特异性转录因子ZmMYB127作为玉米籽粒玻璃质胚乳（VE）形成的正向调控因子。研究发现ZmMYB127通过与OPAQUE2（O2）协同激活α-玉米醇溶蛋白基因表达，并与PBF1互作抑制淀粉合成基因（Bt1、Ae1等），从而拮抗性调控贮藏物质积累。更值得注意的是，该转录因子通过负调控吲哚-3-乙酸（IAA）合成关键基因De18和TAR1的表达，影响胚乳发育进程。该研究为玉米品质改良提供了重要的遗传资源和理论依据，对谷物品质育种具有重要指导意义。

　　

1 引言

玉米（Zea mays L.）作为全球重要的粮食和饲料作物，其籽粒质地是影响食品、饲料及工业应用的关键农艺性状。胚乳玻璃质度（endosperm vitreousness）是衡量籽粒质地的核心指标，主要由周边玻璃质胚乳（vitreous endosperm, VE）与中央粉质胚乳（starchy endosperm, SE）的比例决定。高玻璃质胚乳比例的籽粒具有更高的密度和容重，能够增强收获、储存和运输过程中的抗物理损伤能力，同时降低病虫害和真菌感染风险。与之相反，粉质胚乳结构疏松、不透明且易碎，更易受到病虫害侵袭。

玻璃质胚乳的形成机制与淀粉-蛋白质基质的紧密程度密切相关。淀粉和贮藏蛋白（主要是玉米醇溶蛋白）作为胚乳的主要组成成分，共同决定玉米的产量和品质。在胚乳灌浆期，淀粉以淀粉颗粒（starch granules, SGs）形式积累于淀粉体中，而玉米醇溶蛋白则以蛋白体（protein bodies, PBs）形式沉积。细胞质中淀粉颗粒被蛋白体和无定形蛋白质包裹，外围胚乳细胞主要充满蛋白体和淀粉颗粒，而中央胚乳细胞则以淀粉颗粒为主且蛋白体稀少。成熟过程中这些组分的凝聚最终形成玻璃质胚乳和粉质胚乳。

玉米胚乳中淀粉和玉米醇溶蛋白的合成主要受转录水平调控，涉及一系列顺式作用元件和转录因子。著名的bZIP类转录因子OPAQUE2（O2）通过识别O2-box激活几乎所有玉米醇溶蛋白基因的表达，同时调控丙酮酸磷酸双激酶（PPDKs）和淀粉合成酶III（SSIII）等淀粉生物合成酶复合体的关键组分。另一个DOF家族转录因子Prolamin-Box Binding Factor（PBF1）与O2物理互作，通过识别醇溶蛋白框（P-box）共同调控淀粉合成基因（SSGs）和玉米醇溶蛋白基因的表达。O2和PBF1的突变会导致玉米醇溶蛋白含量急剧下降，形成不透明的粉质胚乳表型。

植物激素在胚乳发育和灌浆过程中发挥重要作用。其中生长素（auxin）是唯一在玉米胚乳灌浆期全程保持高水平的内源激素。吲哚-3-乙酸（IAA）作为主要天然生长素，主要通过色氨酸依赖的吲哚-3-丙酮酸（IPA）途径合成。Defective18（De18，又称ZmYUC1）负责玉米胚乳特异性IAA合成，其突变体de18表现出胚乳细胞分裂减少和籽粒变小。最近的空间转录组研究表明，IAA合成相关基因在玻璃质胚乳和粉质胚乳中均高表达，表明调控网络中的某些基因可能受到共同转录因子的调控。

2 结果

2.1 通过GWAS鉴定ZmMYB127与玉米胚乳玻璃质度的关联

为了评估成熟籽粒的胚乳玻璃质度，研究团队在三个环境（2019CZ、2019XX和2020CZ）下收集了238个玉米自交系样本，采用多阈值分割技术测量成熟籽粒的相对玻璃质胚乳面积（RVE）。结果显示不同自交系间RVE存在显著变异，范围从10.12%到79.45%不等。群体结构分析表明，Iodent亚群的自交系在三个环境中均表现出显著较低的RVE值，而SPT亚群则具有最高的RVE值。

通过全基因组关联分析（GWAS），使用2,432,795个高质量SNP和三个环境的RVE表型数据，采用FarmCPU模型进行关联分析，共鉴定出309个与RVE显著相关的SNP。其中，在染色体3上发现一个显著位点（qRVE3-2）与所有三个环境的RVE均强烈相关，该位点内所有显著SNP均与同一个候选基因ZmMYB127相关联。

进一步对ZmMYB127编码序列（CDS）及其上下游2000bp区域的SNP进行关联分析，发现69个SNP，其中三个相邻SNP（位于启动子区的S3_144357539、5'-UTR区的S3_144357707和外显子区的S3_144357771）是与RVE最显著相关的SNP，在玉米群体中呈现强连锁不平衡。基于这些SNP的变异，将238个玉米自交系分为5种单倍型，其中HAP1（GTC）和HAP2（ACG）是两个主要单倍型。表型分析显示HAP2成员的RVE显著高于HAP1，但百粒重无显著差异。转录组数据和RT-qPCR分析均证实HAP2籽粒中ZmMYB127表达量显著高于HAP1。瞬时表达试验进一步表明，ZmMYB127^?216A（HAP2）启动子的活性显著高于ZmMYB127^?216G（HAP1）启动子。这些结果强有力地表明，ZmMYB127的自然变异通过改变基因表达水平与玉米胚乳玻璃质度高度相关。

2.2 ZmMYB127的功能验证

为研究ZmMYB127在调控胚乳玻璃质度中的生物学功能，研究团队利用CRISPR-Cas9系统在KN5585自交系中构建了敲除突变体。设计了针对ATG附近外显子的guide RNA靶位点，获得了两个独立的敲除系Ko-1和Ko-2，分别携带5-bp缺失和1-bp缺失突变。两种突变均导致早期移码和提前终止密码子。杂合子（Ko-1/+和Ko-2/+）和纯合子（Ko-1和Ko-2）植株的自交果穗显示，杂合植株后代分离出不透明和正常籽粒，比例符合1:3，而纯合植株只产生不透明籽粒。等位性测验表明Ko-1和Ko-2是等位基因。值得注意的是，这些等位基因产生的籽粒比野生型KN5585更大，长度和厚度显著增加，宽度不变。

研究还构建了在KN5585背景中由Ubiquitin（Ubi）启动子驱动ZmMYB127过表达的转基因株系。两个独立的过表达系OE-1和OE-2表现出显著升高的ZmMYB127表达水平，在光箱中显示更强的透光性和减小的籽粒大小。与野生型KN5585籽粒相比，ZmMYB127-OE籽粒的长度和宽度显著减小，厚度不变。横纵切面观察显示，Ko-1和Ko-2籽粒周边区域的玻璃质胚乳区域少于野生型，而两个ZmMYB127-OE株系则表现出更大的玻璃质胚乳区域。具体而言，Ko-1和Ko-2籽粒的玻璃质胚乳比例比野生型分别减少31%和25%，而过表达株系则增加11%和10%。与RVE值一致，Ko-1和Ko-2籽粒的容重显著降低，而过表达株系的容重增加。然而，成熟期百粒重在野生型、敲除和过表达株系间无显著差异。

扫描电镜（SEM）分析显示，Ko-1和Ko-2株系的粉质胚乳区域淀粉颗粒大于野生型和过表达株系。敲除株系玻璃质胚乳区域的淀粉颗粒嵌入的蛋白质基质少于野生型和过表达株系。基于全籽粒干粉的淀粉含量测定表明，Ko-1和Ko-2株系的淀粉含量高于野生型（分别多4.5%和3.7%），而过表达株系的淀粉含量较低（分别少3.0%和1.9%）。此外，从成熟籽粒中提取玉米醇溶蛋白和非醇溶蛋白进行SDS-PAGE和生化分析，结果显示敲除株系的玉米醇溶蛋白含量大幅减少，特别是19-kD α-玉米醇溶蛋白。由于玉米醇溶蛋白约占胚乳总蛋白含量的60%，非醇溶蛋白水平的轻微增加无法补偿总体蛋白的减少，因此敲除株系的总蛋白含量较低。相反，过表达株系的玉米醇溶蛋白和总蛋白含量显著增加，非醇溶蛋白含量在野生型和过表达株系间无显著差异。

在B104自交系中也构建了敲除突变体，获得了一个携带1-bp插入的CRISPR/Cas9突变体Ko-B1。该突变体表现出与KN5585背景中敲除株系相似的表型，具有不透明和大籽粒特征，Ko-B1籽粒完全非玻璃质。B104胚乳周边区域为玻璃质，而Ko-B1胚乳完全为粉质。此外，Ko-B1籽粒中大多数氨基酸水平较低，但玉米醇溶蛋白中缺乏的赖氨酸总量显著增加。Ko-B1籽粒中大多数游离氨基酸低于B104，但游离脯氨酸含量是B104的三倍。

2.3 ZmMYB127是胚乳特异性R2R3-MYB转录因子

蛋白质序列分析显示，ZmMYB127由263个氨基酸组成，具有R2R3-MYB亚家族特征的两个SANT结构域，未发现其他保守结构域。系统发育树分析表明，ZmMYB127在单子叶植物中高度保守，与小麦中的TaMYB44-4D和水稻中的OsMYB44亲缘关系最近。

半定量RT-PCR在不同玉米组织中的分析表明，ZmMYB127特异性在胚乳中表达。随后的RT-qPCR分析证实，其在授粉后9至27天（DAP）保持高表达，在12 DAP达到峰值，与更新的玉米基因图谱数据一致。此外，RNA原位杂交显示ZmMYB127在玻璃质胚乳细胞中大量表达，在粉质胚乳细胞、糊粉层（AL）和传导区（CZ）也有明显信号，而在基胚乳转移层（BETL）仅观察到残留信号。这种空间分布与公共RNA-Seq数据一致。

为研究ZmMYB127的功能特性，评估了其亚细胞定位和转录激活能力。将全长ZmMYB127基因与增强型GFP（eGFP）融合，在组成型35S启动子下在玉米叶肉原生质体和洋葱表皮细胞中表达。与游离eGFP不同，ZmMYB127-GFP信号 exclusively 定位于细胞核。酵母转录激活试验表明ZmMYB127缺乏转录活性，双荧光素酶报告基因（DLR）试验进一步证实ZmMYB127作为转录抑制子发挥作用。

2.4 ZmMYB127差异调控淀粉和玉米醇溶蛋白合成

为深入阐明ZmMYB127对籽粒质地的调控效应，研究对Ko-1和野生型KN5585籽粒在15 DAP进行了转录组深度测序（RNA-Seq）。鉴定出5178个注释的差异表达基因（DEGs），其中2459个基因上调，2719个基因下调。

基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，这些基因与营养贮藏活性、淀粉和蔗糖代谢、糖酵解和氨基酸合成途径显著相关。值得注意的是，核心淀粉合成基因（SSGs）（包括Bt2、Bt1、Ae1、Su1和Pho1）的表达在Ko-1籽粒中显著增加。RT-qPCR分析进一步证实了它们的表达模式，并显示两个数据集间存在整体相关性。另一方面，19-kD和22-kD α-玉米醇溶蛋白（占玉米醇溶蛋白总量的60%-70%）以及27-kD γ-玉米醇溶蛋白（对玉米醇溶蛋白体和玻璃质胚乳形成至关重要）基因的表达呈现 divergent 变化，高表达基因普遍下调，特别是19-kD α-玉米醇溶蛋白（z1D）。RT-qPCR进一步证实，19-kD（z1A、z1B、z1D）和22-kD（z1C）α-玉米醇溶蛋白的转录本水平在Ko-1中有不同程度降低，其中19-kD z1D几乎检测不到，27-kD γ-玉米醇溶蛋白保持不变。与这些发现一致，Ko-1胚乳显示出比野生型更多的淀粉颗粒和更少的蛋白体。这些结果表明，zmmyb127突变导致胚乳中贮藏蛋白和淀粉合成的显著改变。

为探索ZmMYB127的潜在直接靶标，将差异表达基因与先前报道的其基因调控网络（GRN）中的基因进行比较。该分析鉴定出69个潜在靶基因，包括35个上调和34个下调的差异表达基因。值得注意的是，三个核心淀粉合成基因（Bt2、Bt1和Ae1）和两个主要玉米醇溶蛋白基因（z1D2和z1C1）被鉴定为ZmMYB127的潜在直接靶标。这些靶基因的GO和KEGG分析显示，在营养贮藏活性和淀粉蔗糖代谢途径中显著富集。启动子序列分析表明，在核心淀粉合成基因和主要玉米醇溶蛋白基因的1.2-kb启动子内存在几个潜在的MYB结合基序。

为确认直接调控，首先进行了酵母单杂交（Y1H）试验。发现ZmMYB127直接结合Bt1、Ae1、z1D2和z1C1的启动子，但不结合Bt2。一致地，电泳迁移率变动分析（EMSA）证明ZmMYB127特异性结合Bt1、Ae1、z1D2和z1C1启动子内的MYB结合位点。增加未标记的野生型探针量显著削弱ZmMYB127与生物素标记探针的结合，而突变的未标记探针无法竞争结合。此外，使用玉米胚乳粒子轰击和玉米叶肉原生质体的瞬时表达试验进一步显示，Ubi-ZmMYB127的共表达 drastically 降低了与Bt1和Ae1启动子相关的LUC活性，同时显著增强了与z1D2和z1C1启动子相关的LUC活性。

2.5 ZmMYB127与PBF1和O2互作调控下游基因

ZmMYB127促进某些主要玉米醇溶蛋白基因的转录但缺乏转录激活能力，表明其必须与其他调控因子互作或形成复合物以协调基因表达。为识别潜在的共调控因子，研究假设它们可能与ZmMYB127具有相似的表达模式，即在胚乳灌浆期高表达。根据先前研究，选择了30个具有相似胚乳灌浆共表达模块的转录因子，发现著名的胚乳特异性转录因子O2因其几乎 identical 的表达模式而成为最佳候选者。考虑到O2和PBF1在调控淀粉合成基因和玉米醇溶蛋白基因中的相互作用，研究也检测了PBF1作为潜在的ZmMYB127互作因子。

随后进行酵母双杂交试验，结果显示共转化ZmMYB127与O2或PBF1的酵母细胞比相应的阴性对照（空载体）生长更好，表明ZmMYB127不仅与O2互作，也能与PBF1在酵母中互作。为确认ZmMYB127与O2或PBF1的相互作用，在本氏烟叶片中进行了分裂荧光素酶互补试验。结果显示，共浸润ZmMYB127-nLUC与O2-cLUC或PBF1-cLUC导致强LUC活性，而其他共浸润中无此活性。此外，在玉米叶肉原生质体中进行了双分子荧光互补（BiFC）试验，在共表达ZmMYB127与O2或PBF1时捕获到细胞核中的强黄色荧光信号，而对照试验中未检测到荧光。此外，进行了GST pull-down试验，证明ZmMYB127直接与O2和PBF1结合。这些结果证实ZmMYB127在体内和体外与O2和PBF1互作。

先前研究揭示，O2和PBF1作为调控玉米胚乳中贮藏蛋白和淀粉合成的调控网络中的关键枢纽。为研究ZmMYB127、O2和PBF1是否共同调控胚乳中的基因调控网络（GRN），根据先前研究比较了受ZmMYB127、O2和PBF1调控的基因。虽然只有27个基因同时受所有三个转录因子调控，但314个基因受ZmMYB127和O2共同调控，占O2调控基因的16.9%，261个基因受ZmMYB127和PBF1共同调控，占PBF1调控基因的30.4%。此外，正如预期，MYB结合位点与P-box或O2-site元件相邻存在于玉米醇溶蛋白基因和核心淀粉合成基因的启动子中，这种串联排列靠近它们的转录起始位点。这些结果表明ZmMYB127、O2和PBF1协同调控靶基因。为验证这一假设，使用效应子和报告子质粒进行瞬时表达分析，以量化ZmMYB127与PBF1或O2对靶基因启动子活性的叠加效应。ZmMYB127和PBF1对Bt1和Ae1启动子活性的 combined 抑制效应显著大于任一转录因子单独的抑制效应。此外，ZmMYB127和O2的共表达导致z1D2和z1C1的转录激活显著强于它们的单独表达。

2.6 ZmMYB127调控胚乳IAA合成相关基因

在zmmyb127和野生型间的差异表达基因中，与激素信号转导相关的基因富集。此外，涉及IAA合成的色氨酸代谢在ZmMYB127的潜在靶标中富集。值得注意的是，两个关键的IAA合成基因De18和TAR1（Tryptophan Aminotransferase Related1）的表达在zmmyb127中根据RNA-seq数据显著增加，这两个基因主要