基于分子印迹聚合物电化学电容传感器实现人血清白蛋白生物标志物的高灵敏检测

本工作报道了一种基于电聚合聚（偶氮-俾斯麦棕Y）分子印迹聚合物（MIP）的无标记、无氧化还原探针电化学传感器，用于高灵敏、高选择性检测人血清白蛋白（SA）。研究通过光谱和电化学手段证实了成功印迹，并利用电化学阻抗/电容谱（EIS/ECS）深入解析了SA再结合时的界面变化与特异性识别机制。该传感器在0.1 Hz下利用真实电容测量实现了对log[SA]（0.25–3.0 ng mL?1）的线性响应，检出限（LOD）低至0.02 ng mL?1，为痕量生物标志物定量分析提供了 robust 的新平台。

　　

1 引言

蛋白源性生物标志物的分析在多种疾病的诊断与监测中变得不可或缺。白蛋白（Serum Albumin, SA）作为一种重要的生物标志物，其异常浓度可提示多种疾病状态，包括代谢紊乱、心血管疾病、营养不良、肾细胞癌乃至SARS-CoV等病毒感染。当前检测白蛋白的方法，如化学发光法、高效液相色谱法、毛细管电泳和免疫分析法等，往往存在耗时、设备昂贵、试剂成本高等问题。因此，开发一种高灵敏、快速且成本效益好的白蛋白检测平台极具吸引力。

分子印迹技术（Molecular Imprinting Technology）因其能创建对目标分子具有特异性结合空腔的传感器而备受关注。分子印迹聚合物（Molecularly Imprinted Polymers, MIPs）是一类模拟生物受体的合成聚合物，对模板分子展现出特异性、灵敏性和分子识别能力。其制备通常涉及功能单体与模板通过范德华力、氢键和π-π相互作用进行预组装，随后聚合，移除模板后留下在形状和功能上模仿目标分子的特异性分子空腔。

电化学技术，特别是电化学电容谱（Electrochemical Capacitance Spectroscopy, ECS），已成为开发和表征仿生电化学传感器的敏感平台。ECS对于基于分析物-分子相互作用的系统尤为有利，使得基于MIP的阻抗型传感器因其固有的选择性和灵敏度而极具吸引力。

2 结果与讨论

2.1 传感器的表征

本研究调查了在电聚合过程中引入SA模板对聚（偶氮-俾斯麦棕Y）（poly(azo-BBY)）薄膜结构的影响。紫外-可见光谱显示，所有三种薄膜（非印迹聚合物NIP、印迹有SA的MIP以及提取SA后的MIP）在紫外区均呈现两个吸收带，位于403和463 nm，分别归属于π-π和n-π跃迁，表明了偶氮聚合物的结构异构化。基于吸收带强度，观察到分子内存在顺反异构现象，且顺式形式略占优势，这与芳香亚单元间有利的π-π相互作用有关。

拉曼散射光谱进一步表征了这些聚合物。所有拉曼光谱均在1379 cm^?1（C─N伸缩）、1521 cm^?1（C═N伸缩）和1576 cm^?1（C═C芳香伸缩）处显示出聚（偶氮-俾斯麦棕Y）的特征峰。602 cm^?1处的峰对应于C─C═N─C键的结构扭曲和顺式偶氮苯异构体。SA-poly(azo-BBY)-MIP相对较弱的拉曼强度表明，由于白蛋白存在于聚合物结构深处，信号受到抑制。提取目标分子后MIP信号的增强表明空腔增多，促进了聚合物内的激发。所有光谱中在1624 cm^?1处观察到的一个峰与胺基的剪式振动有关。该峰在SA-poly(azo-BBY)-MIP中强度较低，表明白蛋白分子与聚合物结构结合位点处存在相互作用。

2.2 器件的电化学性能

NIP和MIP薄膜的电聚合曲线显示，电聚合起始于BBY单体中伯芳香胺的不可逆氧化（在第一周电位扫描中于+0.85 V vs. SCE处观察到）。在后续扫描圈数中，随着聚合物膜生长并钝化电极表面，该初始氧化电流减小，同时在较低电位处出现对应于形成的偶氮聚合物的氧化还原峰。虽然在相同条件下MIP形成的电流密度明显低于NIP，表明庞大的SA模板分子阻碍了BBY单体向电极表面的扩散，导致有效聚合速率稍慢，但基本的伏安特征保持一致，表明SA的掺入并未阻止聚（偶氮-BBY）骨架的形成。

使用循环伏安法进一步表征了模板掺入和去除的电化学影响。保留模板的MIP薄膜（SA-poly(azo-BBY)-MIP）和提取模板后的薄膜（(??)-poly(azo-BBY)-MIP）的循环伏安图均显示出聚（偶氮-BBY）骨架的特征氧化还原信号，在-0.2至+0.2 V之间观察到对应于偶氮基团的宽峰。然而，SA-poly(azo-BBY)-MIP与偶氮氧化还原过程相关的峰值电流以及整体电容电流均显著高于提取模板后的(??)-poly(azo-BBY)-MIP，这表明SA模板分子在聚合物基质内的存在可能促进了电荷转移动力学或增强了这些动态伏安条件下氧化还原位点的可及性。

通过阻抗谱（EIS）研究发现，SA-poly(azo-BBY)-MIP电极的电容弧小于(???)-poly(azo-BBY)-MIP电极。在无氧化还原探针的情况下，电荷转移电阻与聚合物基质中偶氮苯/氢化偶氮苯 moiety 耦合质子相关。较小的电容弧可归因于聚合物位点与蛋白质结构（主要是相对于偶氮单元的氢键相互作用）的相互作用。通过使用“氧化还原嵌入”状态下的复电容研究确定了氧化还原电容。根据复电容结果，在MIP表面蛋白质解吸后，氧化还原电容弧明显减小，从9.5 μF cm^?2（SA-poly(azo-BBY)-MIP）变为7.6 μF cm^?2（(???)-poly(azo-BBY)-MIP）。

从阻抗数据拟合获得的参数表明，白蛋白的存在显著影响了聚（偶氮-BBY）-MIP的电化学行为。白蛋白提取后R₁的减小与聚合物/溶液界面处非导电屏障的移除一致。另一方面，白蛋白提取后R₂的急剧增加可以通过白蛋白与聚合物氧化还原活性位点之间的氢键相互作用来解释。当白蛋白被移除后，这些氢键相互作用丧失，导致R₂显著增加。CPE值的变化反映了由于白蛋白的存在或缺失而引起的聚合物表面改性。

为了确认溶液中白蛋白与(???)-poly(azo-BBY)-MIP表面印迹位点的再结合，在存在和不存在血清白蛋白的PBS溶液中进行了EIS/ECS测量。同时使用聚（偶氮-BBY）的非印迹聚合物（NIP）作为对照进行平行测量。(???)-poly(azo-BBY)-MIP在含有0.5 ng mL^?1 SA的PBS溶液中的阻抗响应显示，其电容弧与不存在SA时相比有所增加，表明电荷转移电阻增大。相反，非印迹聚合物（NIP）在添加SA后电容弧没有显著变化，这证实了(???)-poly(azo-BBY)-MIP中观察到的变化是由于白蛋白与印迹位点之间的特异性相互作用所致。

复电容响应为了解血清白蛋白（SA）与分子印迹聚合物及非印迹对照之间的相互作用提供了进一步的信息。(???)-poly(azo-BBY)-MIP的复电容响应显示，在向PBS溶液中添加0.5 ng mL^?1 SA后，该氧化还原电容弧的大小明显减小。这种弧大小的减小直接表明SA再结合到了(???)-poly(azo-BBY)-MIP内的印迹位点上。相反，聚（偶氮-BBY）-NIP在添加SA后其氧化还原电容弧几乎没有变化。MIP中氧化还原电容弧的减小以及拐点的移动与SA占据氧化还原活性位点有关。

Bode图（虚电容对频率对数）为了解SA-聚合物相互作用提供了进一步见解，突出了频率依赖的电容行为，并允许确定弛豫时间常数（τ_r）。比较不存在SA时的MIP和NIP，NIP表现出比MIP显著更长的τ_r（0.58 ms vs. 0.28 ms），反映了MIP因印迹而产生的更结构化环境，这有利于更快的电荷传输和氧化还原过程。添加SA后，MIP的弛豫时间基本保持不变，这证实了虽然氧化还原过程的程度减小，但其速率并未受到SA再结合的显著影响。相反，NIP在添加SA后显示出τ_r显著增加（从0.58 ms到0.74 ms），支持了非特异性白蛋白吸附的存在，这阻碍了离子移动并减慢了界面过程。

根据Bueno和Davis的研究，电子转移速率常数（k_r）与弛豫时间成反比（k_r = 1/τ_r）。因此，不存在SA时MIP较短的弛豫时间对应于更快的电子转移速率（k_r = 3.57 ms^?1），而NIP的速率较慢（k_r = 1.72 ms^?1），这与MIP更有序的结构能促进氧化还原活性偶氮苯/氢化偶氮苯 moiety 与电极间更好的电子耦合相一致。SA再结合到MIP并不影响剩余可及位点的k_r，而向NIP添加SA会降低k_r，这与受阻的电子转移一致。虚电容峰的半高全宽（FWHM）提供了关于氧化还原过程动力学分散度的信息。较大的FWHM表明弛豫时间分布更广，提示电子转移动力学具有更大的异质性。发现(???)-poly(azo-BBY)-MIP的FWHM为1.376，而聚（偶氮-BBY）-NIP的FWHM显著更大，为1.966。这一结果清楚地表明，MIP表现出比NIP更低的动力学分散度。MIP的较窄峰表明电子转移环境更均一，与其更有序的结构一致。相反，NIP的更宽峰（更大的FWHM）表明更大的动力学分散度，正如缺乏明确结合位点的非印迹聚合物所预期的那样。添加SA并未显著改变峰宽和FWHM。

2.3 分子印迹聚合物器件的分析性能

图4展示了(???)-poly(azo-BBY)-MIP传感器使用EIS（特别是在中低频区域）针对不同浓度SA生物标志物进行评估的分析性能。为了确保技术的可靠性和灵敏度，这些测量使用三个独立制备的传感器进行三次重复。监测了复电容、实电容和虚电容在浓度范围（0.0至3.0 ng mL^?1）内的变化。所有三种从EIS测量推导出的电容参数都显示出对SA浓度的明确依赖性。随着SA浓度增加，氧化还原电容弧减小，并且实电容和虚电容值均减小，尤其是在较低频率下。该行为表明随着更多SA分子结合，印迹空腔被逐渐填充且分子膜表面发生加载。所有参数的整体趋势表明了一个表面饱和过程，与吸附等温线模型一致，这对于基于达到容量的特异性结合位点的传感器是预期的。

直接从氧化还原电容（C_redox）推导并针对线性SA浓度绘制的分析曲线显示，随着[SA]增加，C_redox减小。然而，这种关系在整个浓度范围内明显是非线性的，表现出与表面饱和相关的特征曲率。仔细观察表明在该曲线内可能存在两个不同的线性响应区域。相反，当将在固定低频0.10 Hz处提取的实电容和虚电容针对SA浓度的对数绘图时，在测试范围内获得了明确的线性关系。实电容和虚电容均随着log[SA]增加而线性减小，这些线性响应分别由方程式（3）和（4）准确描述。比较灵敏度（由线性校准曲线的斜率确定）表明，在此范围内，在0.10 Hz下测量的实电容对SA浓度的变化提供最高的灵敏度（更陡的斜率）。

由于实电容为SA检测提供了最高的灵敏度，因此使用该参数确定了MIP传感器的检测限（LOD）。由于在基于结合的测定中，传感器响应与分析物浓度之间通常存在固有的S形关系，反映了表面饱和，通过将四参数逻辑（4PL）方程通过非线性回归分析拟合到实电容数据（对线性SA浓度绘图）来计算LOD。基于拟合到实电容数据的四参数逻辑（4PL）模型，计算出SA的检测限（LOD）为0.02 ng mL^?1。与近期用于SA的电化学MIP传感器相比，当前的无探针、实电容器件提供了低ng mL^?1级的灵敏度，工作范围为0.25–3.0 ng mL^?1。

通过将实验数据（源自氧化还原电容变化ΔC_redox）使用线性化图拟合到各种等温线模型，研究了白蛋白与(???)-poly(azo-BBY)-MIP结合的亲和力和机制。使用线性化Langmuir图的分析显示在该浓度范围内呈现强线性相关性（r = 0.9948）。这表明Langmuir模型（假设在有限数量的均质位点上发生单层吸附）为结合数据提供了良好的数学描述。该拟合允许估计Langmuir参数，与印迹过程中创建的特异性、可饱和结合位点存在一致（K_L = 0.240 ng mL^?1）。

然而，根据线性化Freundlich模型绘制数据为了解相互作用的复杂性提供了关键见解。该图清楚地显示出斜率变化，表明结合机制无法通过单个Freundlich关系在整个浓度范围内描述，并且在ln[SA] ≈ 0附近存在明显的转变点。尽管两个区域的Freundlich亲和常数（K_F）在数值上相似（0.481 vs. 0.465，从图5B中的截距获得），但指数（n₁ vs. n₂）的明显差异突出显示了 governing 两个浓度范围的吸附能量学根本不同。在较低浓度（ln[SA] < 0）下，斜率（1/n₁ = 1.118，r = 0.9991）陡峭且大于1，而在较高浓度下，斜率（1/n₂ = 0.581，r = 0.9990）变得显著更平缓且小于1。

该断点支持了一种双区域结合机制：初始区域由对印迹位点的高亲和力结合主导，随后当浓度增加且非特异性吸附在初级位点饱和后在聚合物表面变得相关时，较低亲和力、异质性相互作用为主的区域。在高SA浓度下，特异性结合区域之外的信号残留增加归因于主要由偶氮/芳香聚合物基质与SA上的疏水性/π-rich区域之间的疏水性和π-π接触驱动的非特异性吸附，并辅以氢键和局部静电相互作用。随着高亲和力印迹空腔饱和，质量作用促进了较浅或较少明确位点的占据以及异质表面域上的吸附，导致校准曲线中出现较平缓的第二斜率。聚（偶氮-BBY）层在位点深度、交联密度和局部孔隙率方面表现出异质性，这赋予了结合能分布；因此，数据可以通过双区域（双Langmuir）或Langmuir-Freundlich（n < 1）描述很好地合理化，而不是单一位点模型。全局Sips（Langmuir-Freundlich）拟合很好地描述了整个浓度范围（图5C），并具有线性。这表明Sips模型（包含了表面异质性）可以有效地描述整个研究浓度范围内的整体结合行为。Sips拟合产生的参数（K_LF = 0.755, 1/n ≈ 1.20）反映了这种平均异质性（n ≠ 1）。异质性因子1/n > 1与印迹过程创建的非理想表面的概念一致。

分子识别和选择性是评估传感器印迹过程有效性的关键参数。针对生物体液中常见的潜在干扰物种评估了选择性，包括血红蛋白（Hb）、葡萄糖氧化酶（GOx）、葡萄糖（Glu）、L-组氨酸（His）、L-酪氨酸（Tyr）、L-半胱氨酸（Cys）、色氨酸（Trp）、L-鸟氨酸（Orn）、牛血清白蛋白（BSA）和尿素。为了测试传感器选择性，在存在这些干扰物的情况下测量了(???)-poly(azo-BBY)-MIP电极的响应，其浓度是参考SA浓度（0.5 ng mL^?1）的1000倍。使用氧化还原电容值监测变化。相对干扰计算为相对于SA信号的百分比变化：[（S_i / S_SA） – 1] × 100%，其中S_i是存在干扰物时的信号，S_SA是单独SA的信号。选择性研究的结果显示，该器件表现出优异的选择性，对于常见临床分析物如葡萄糖、各种氨基酸（His, Tyr, Cys, Trp, Orn）、尿素和酶葡萄糖氧化酶，即使在高干扰物浓度下，干扰值也低于5%。牛血清白蛋白（BSA）与SA结构相似，仅显示出8%的中等干扰。这种与BSA相对较低的交叉反应性突出了印迹过程在创建针对SA的特异性识别位点方面的有效性，可能涉及与区分目标分子的功能基团的相互作用。然而，观察到对血红蛋白（Hb）的显著干扰，超过15%。这种干扰水平是预期的，并且可能归因于氧化还原活性聚（偶氮-BBY）薄膜与血红蛋白内血红素基团之间可能发生的电荷转移相互作用，特别是在测试的高相对浓度下（1000倍过量）。在实际使用中，可以通过样品稀释（以降低[Hb]:[SA]比率）以及在测量前必要时进行短暂的离传感器选择性提取/富集SA来最小化干扰。

最后，评估了(???)-poly(azo-BBY)-MIP传感器的重现性和稳定性以评估其实际可行性。通过将传感器在0.5 ng mL^?1 SA溶液中孵育以促进分析物再结合后，监测实电容信号来研究这两个参数。为了评估制备重现性，测试了七个独立制备的MIP传感器在相同分析物水平下的响应，并将其响应归一化到批次平均值（设为100%）。相对响应集中在1附近（90–112%），相对标准偏差（RSD）为8.98%，这表明该制备路线具有良好的传感器间重现性。单个传感器在14天内监测的响应（归一化到第1天=100%）显示出较低的日间变异性（RSD 9.56%）。虽然在后期时间点观察到适度的向上漂移，但未发生活性损失，表明在两周内保持了传感能力。

3 结论

本工作成功开发并表征了一种基于分子印迹聚合物的新型电化学传感器，用于无需外部氧化还原探针即可灵敏检测人血清白蛋白（SA）。使用EIS和ECS的比较研究明确证明了传感器的特异性分子识别能力。SA与MIP的再结合导致电荷转移电阻显著增加和相应的电容参数减小，这与聚合物活性位点附近印迹位点的特异性占据一致。相反，非印迹聚合物（NIP）表现出可忽略的特异性响应，主要显示在低频和双电层电容中存在非特异性吸附的迹象。弛豫时间（τ）和动力学分散（FWHM）的详细分析进一步阐明了结合机制，显示MIP具有更快的本征动力学，并证实SA结合主要阻断位点的访问而非改变本征速率，而非特异性吸附减慢了NIP上的动力学。虽然氧化还原电容为了解结合提供了直接见解，但在低频（0.10 Hz）下测量的实电容（C'）提供了最高的灵敏度，在0.25–3.0 ng mL^?1范围内产生了针对log[SA]的线性校准曲线。使用4PL模型拟合实现了0.02 ng mL^?1的检测限（LOD），与几种先前报道的SA传感器相比显示出卓越的灵敏度。实现的低检测限突出了该方法在需要痕量定量白蛋白和其他相关蛋白质生物标志物的生物分析应用中的潜力。等温线分析揭示了一种双区域结合机制，起始于低浓度下的特异性Langmuir型相互作用，随后在较高浓度下是Freundlich型非特异性吸附，其中Sips模型有效地描述了整体异质性结合。该传感器对常见生理干扰物表现出良好的选择性，尽管在高浓度下来自血红蛋白的显著干扰提示了潜在的电荷转移相互作用。

4 实验部分

实验部分详细描述了所使用的化学品、材料、分子印迹聚合物基传感器的制备、M传感器的电化学研究、光学表征以及统计分析所采用的方法。所有电化学测量均使用三电极系统在脱氧的PBS溶液中进行。传感器通过循环伏安法电聚合制备，并使用EIS/ECS进行表征。UV-vis和拉曼光谱用于光学表征。所有分析性能、选择性、重现性和稳定性测量均使用独立制备的传感器进行三次重复（n = 3），数据以平均值±标准差（SD）表示，并使用OriginPro软件进行数据处理和曲线拟合。