大豆和玉米中时空调控重组酶表达实现选择标记基因高效自动切除的研究

本刊推荐：为解决转基因作物中筛选标记基因残留问题，研究人员开展Cre-lox系统时空调控研究，通过RNA-seq筛选生殖组织特异性启动子驱动重组酶，在T0代实现标记基因自动切除（autoexcision），使大豆和玉米分别获得8.54%和17.2%的纯合标记剔除株系，为转基因作物商业化开发提供高效标记清除技术方案。

　　

在现代农业生物技术领域，转基因作物的培育常需借助选择标记基因（selectable marker gene）来筛选成功转化的细胞。然而，这些标记基因在完成筛选使命后，反而成为转基因作物商业化道路上的"包袱"——它们不仅可能导致基因叠加时的冗余问题，还容易引发公众对安全性的担忧。传统的标记基因剔除方法往往需要通过有性杂交或多代选育，费时费力且效率低下。如何在不影响转化效率的前提下，实现标记基因的精准、高效剔除，成为困扰研究人员的一大难题。

近日，O'Brien等人在《BMC Plant Biology》发表的研究成果为解决这一难题提供了创新性方案。研究人员巧妙利用噬菌体P1来源的Cre-lox重组系统，开发了一种时空调控的自动切除（autoexcision）技术，能够在大豆和玉米中实现选择标记基因的高效剔除，同时保证足够的转化体获得率。该技术的核心在于对Cre重组酶表达模式的精细调控——既不能表达太早（否则会导致转化细胞因丢失标记基因而被淘汰），也不能表达太晚或不足（否则无法有效切除标记基因）。

为达到这一精妙平衡，研究团队采用了基于RNA-seq数据的生物信息学方法，从大豆和玉米的生殖相关基因中挖掘具有时空特异性表达模式的调控元件。这些元件来自在花分生组织、配子或早期胚中专一高表达的基因，能够驱动Cre重组酶在适当的发育阶段和部位表达，从而在转化体成活率和标记基因剔除效率之间找到最佳平衡点。

研究过程中，团队主要运用了以下几项关键技术：基于RNA-seq数据的组织特异性表达元件挖掘技术、农杆菌介导的植物遗传转化技术（Agrobacterium-mediated transformation）、TaqMan定量PCR检测技术以及GUS组织化学染色技术（使用X-Gluc作为底物）。其中大豆和玉米材料来自精英品种，RNA-seq数据包含公共和专属来源。

Spatio-temporal regulation of recombinase expression enables efficient autoexcision of selectable marker genes in soybean and maize

研究人员首先构建了包含选择标记基因、CRISPR/Cas编辑工具和目的基因（GOI）的T-DNA载体，其中标记基因和Cre表达盒两侧均安装loxP位点。当Cre重组酶表达时，会介导两个loxP位点间的重组，从而将标记基因和Cre基因自身一并切除，实现"自毁"式清除。

Curation of novel expression elements

通过分析大量RNA-seq数据（补充表S1），团队筛选出在生殖组织中特异性表达的基因，并从中获取启动子、5'非翻译区（UTR）、内含子和3'UTR等调控元件。这些元件来自花分生组织、花序分生组织、配子或早期胚中高表达的基因，如大豆Glyma.Mads17和玉米Zm.Traf29等。

Plant transformation and cultivation

通过农杆菌介导的转化技术将测试载体导入大豆和玉米中，发现不同Cre表达盒对转化效率的影响差异显著。某些元件（如Zm.Ra3、Zm.Mtf32和Zm00001d018050）使转化效率降至非自动切除对照载体的60%以下，而高效元件（如Glyma.AP1和Zm.Traf29）则对转化效率影响较小。

Detection of marker, Cre, and GOI DNA

采用TaqMan定量PCR技术检测T₁代植株中标记基因、Cre基因和目的基因的拷贝数。成功的自动切除事件需同时满足：目的基因为纯合（拷贝数2）或杂合（拷贝数1），而标记基因和Cre基因均检测不到（拷贝数0）。

GUS reporter gene characterization

为进一步验证筛选到的调控元件的表达模式，研究人员将Cre基因替换为GUS报告基因，通过X-Gluc染色观察组织特异性表达情况。结果显示，成功驱动自动切除的元件确实在生殖系组织或其前体细胞中具有活性，但也存在一定程度的其他组织表达。

Results

实验结果表明，使用生殖组织特异性元件驱动Cre表达可实现高效的自动切除。在大豆中，Glyma.AP1元件组合使纯合标记剔除（homozygous marker-free）植株比例达到8.54%；在玉米中，Zm.Traf29元件与一段随机DNA序列ISR4组合使这一比例达到14.3-17.2%。总体而言，大豆测试元件的成功率为22%（2/9），玉米为7.7%（1/13）。

Discussion

研究表明，基于RNA-seq表达模式筛选调控元件的方法虽然有效，但成功率仍有提升空间（大豆22%，玉米7.7%）。这可能与转基因背景下元件的表观遗传沉默、远端调控元件的缺失、或者载体上下文效应有关。研究人员发现，在玉米中添加1.2kb的随机间隔序列ISR4可能有助于提高切除效率，但此效果具有元件特异性。

GUS染色结果显示，成功驱动自动切除的元件虽然在目标生殖组织中具有活性，但也存在一定程度的"泄漏表达"。这种表达模式与理想中的仅限于生殖细胞晚期表达的预期有所出入，可能由以下因素导致：GUS与Cre编码序列特性差异、马铃薯LS1内含子中的调控 motif、或者植物对早期部分体细胞中标记基因切除的耐受性。

Conclusions

该研究证实了基于转录组数据筛选生殖组织特异性表达元件的方法可有效驱动Cre重组酶介导的自动切除系统。靶向花分生组织、配子和/或早期胚的调控元件能够实现高效、可遗传的标记基因剔除，且不对转化效率造成显著影响。这项技术为大豆和玉米等作物的转基因性状商业化开发提供了快速、经济、高效的标记基因清除方案。

该研究的创新之处在于将高通量转录组数据与精密的重组酶技术相结合，建立了基于生殖发育时空特异性表达的标记基因剔除系统。不仅为解决转基因作物中的标记基因残留问题提供了有效技术手段，也为其他需要精密调控基因表达的植物生物技术应用提供了重要参考。随着这项技术的进一步完善和推广，有望加速转基因作物的商业化进程，同时提高公众对转基因产品的接受度。