多组学与田间实验揭示Palleroniana假单胞菌P6促进重楼生长及重楼皂苷积累的机制

本研究针对药用植物重楼生长缓慢、活性成分积累不足的产业难题，通过分离筛选具有溶磷解钾固氮功能的根际促生菌株，结合基因组学、田间试验及转录组分析，系统揭示了Pseudomonas palleroniana P6通过调节土壤养分、植物激素信号转导及萜类合成通路，显著提升重楼生物量与重楼皂苷I、II、VII含量的作用机制，为微生物菌剂在珍稀药用植物栽培中的应用提供了理论依据和实践方案。

　　

在传统中医药宝库中，重楼（Paris polyphylla）以其卓越的止血、镇痛、抗菌和抗肿瘤功效占据重要地位，是云南白药、重楼解毒酊等80余种中成药的核心成分。其药理活性的物质基础主要来源于一类名为重楼皂苷（polyphyllins）的甾体皂苷类化合物，其中重楼皂苷I、II、VI和VII的活性尤为显著。例如，重楼皂苷I可通过诱导自噬激活AMPK（AMP-activated protein kinase）通路来抑制非小细胞肺癌的生长；重楼皂苷II则通过抑制AKT/NF-κB通路来阻止肝细胞癌的增殖。

然而，巨大的市场需求（年需求量约1500吨）与严峻的供给现实形成了巨大矛盾。野生重楼资源已无法满足需要，而人工栽培却面临着重楼生长缓慢、成熟周期极长（通常需5-7年）以及环境适应性差等瓶颈。这使得重楼的可持续栽培和商业化生产变得异常困难，特别是其关键活性成分——重楼皂苷的积累问题。

面对这一挑战，科学家们将目光投向了自然界中与植物协同进化的微小盟友——植物根际促生细菌（Plant Growth-Promoting Rhizobacteria, PGPR）。这类细菌能够通过固氮、溶磷、解钾等作用改善植物营养状况，并通过分泌植物激素（如吲哚乙酸IAA）和铁载体（siderophore）等物质直接促进植物生长和增强抗逆性。前期研究表明，重楼在生长过程中会从其根际和土壤中有选择性地富集假单胞菌属（Pseudomonas）、根瘤菌属（Rhizobium）和土壤杆菌属（Agrobacterium）等有益微生物，这暗示了微生物接种剂在解决重楼栽培难题方面的巨大潜力。

为了系统探索PGPR对重楼生长和次生代谢的促进作用，Wu等研究人员在《BMC Plant Biology》上发表了他们的最新研究成果。他们从重楼根际土壤中分离筛选功能性菌株，通过多组学技术和田间实验相结合的方法，深入揭示了Palleroniana假单胞菌P6（Pseudomonas palleroniana P6）的促生机制及其对重楼皂苷生物合成的调控网络，为开发高效的微生物菌剂提供了扎实的科学依据。

本研究主要采用了以下关键技术方法：从云南大理重楼种植基地的根际土壤中分离筛选具有溶磷、解钾和固氮功能的细菌菌株；通过草本植物幼苗盆栽试验评估菌株的促生效果；对优选菌株P6进行全基因组测序（采用Illumina Hiseq和PacBio平台）和功能基因注释分析；在云南大理南塘田村重楼种植基地设计田间试验，设置接种P6菌剂处理组（OP/FP）和清水对照组（OC/FC）；采用常规化学方法测定土壤理化性质；通过高效液相色谱（HPLC）和液质联用（LC-MS）技术分析重楼根部生物量和重楼皂苷含量；对重楼根组织进行转录组测序（Illumina HiSeq平台）和差异表达基因分析。

多组学与田间实验揭示Palleroniana假单胞菌P6促进重楼生长及重楼皂苷积累的机制

功能菌株的分离与鉴定

研究人员从重楼根际土壤中成功分离出25株具有无机磷溶解、钾 solubilizing 和固氮能力的菌株，主要属于芽孢杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和根瘤菌属（Rhizobium）。通过在不同选择性培养基上的生长情况评估，发现大多数菌株具有多重功能，特别是假单胞菌属的N4和N5菌株同时具备三种功能。其中，假单胞菌P6在无机磷培养基和溶解钾培养基上生长最快，显示出优异的溶磷解钾能力。

最佳促生菌株P6的筛选

通过草本植物幼苗试验发现，接种P6菌株的处理组在株高（增加16.56%）、根长（增加43.01%）和每株根数（增加44.44%）方面均显著优于对照组。此外，Salkowski试剂测试证实P6菌株能够合成植物生长促进物质吲?哚乙酸（IAA），且在添加L-色氨酸（IAA合成的重要前体）的培养液中IAA产量更高。

P6菌株的全基因组分析

全基因组测序表明，Palleroniana假单胞菌P6的基因组大小为6,558,226 bp，包含一条染色体和一条质粒。通过16S rRNA序列比对和平均核苷酸一致性（ANI）分析，将该菌株鉴定为Palleroniana假单胞菌（Pseudomonas palleroniana P6）。功能注释发现，其基因组中含有与磷溶解相关的基因（如phoB、phoD、phoU、eno、gcd和pqq系列基因），这些基因编码的酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和葡萄糖脱氢酶等能够通过产生有机酸（如葡萄糖酸）来溶解土壤中的无机磷和钾矿物。此外，基因组中还含有完整的色氨酸和IAA合成途径基因（trpA-G和speA、C），以及一个11,929 bp的铁载体合成基因簇，解释了其促生能力和铁获取机制。

田间试验效果评估

田间试验结果表明，接种P. palleroniana P6显著改变了土壤理化性质。处理组（FP）土壤pH值降低更明显（从6.14降至5.50），有效钾（AK）含量从0.24 g/kg显著增加至0.26 g/kg，而对照组（FC）的AK含量则下降。这表明P6菌剂通过其溶钾作用减缓了土壤钾素的消耗。

更重要的是，P6菌剂处理显著促进了重楼的生长和活性成分积累。处理组重楼根部的鲜重和干重分别增加了23.30%和22.37%。通过LC-MS分析发现，处理组中主要重楼皂苷成分含量显著升高：重楼皂苷II、VII和I的含量分别增加了14.08%、66.33%和30.79%，其中重楼皂苷VII的增加幅度最为显著。

转录组学机制揭示

转录组分析揭示了P6菌剂作用的分子机制。与对照组相比，处理组重楼根部有521个差异表达基因（DEGs），其中371个基因上调，150个下调。GO功能富集分析显示，上调基因显著富集在胆固醇合成与代谢相关功能中，如反向胆固醇转运（reverse cholesterol transport）、胆固醇稳态（cholesterol homeostasis）、胆固醇结合（cholesterol binding）和胆固醇生物合成过程（cholesterol biosynthetic process）。胆固醇是重楼皂苷生物合成的重要前体物质，其代谢活性的增强直接促进了重楼皂苷的合成。

KEGG通路富集分析表明，萜类骨架生物合成（terpenoid backbone biosynthesis）、植物激素信号转导（plant hormone signal transduction）、戊糖磷酸途径（pentose phosphate pathway）、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）和糖酵解/糖异生（glycolysis/gluconeogenesis）等通路显著上调。特别是萜类骨架生物合成通路中的角鲨烯环氧酶（squalene monooxygenase, SQLE）和环阿屯醇合酶（cycloartenol synthase, CAS）等关键酶基因表达上调，这些酶是胆固醇和甾体皂苷生物合成途径中的关键催化酶。同时，植物激素信号转导通路中的生长素运输蛋白BIG（auxin transport protein BIG）基因也显著上调，这可能促进了P6产生的IAA向植物体内的运输，从而刺激根系发育和整体生长。

结论与意义

本研究系统探讨了菌剂Palleroniana假单胞菌P6对濒危药用植物重楼的促生作用和次生代谢调控机制。研究发现P6菌株能够通过多种机制促进重楼生长和重楼皂苷积累：一是通过产生有机酸和磷酸酶溶解土壤中的无机磷和钾，提高养分有效性；二是通过合成IAA和铁载体直接刺激植物生长和改善铁营养；三是通过调控植物体内胆固醇合成、萜类骨架生物合成和能量代谢相关基因的表达，促进重楼皂苷的生物合成。

该研究的创新之处在于将传统的菌株分离筛选与现代多组学技术（基因组学、转录组学）相结合，并通过田间试验验证，全面解析了PGPR菌剂的作用机制。研究结果不仅为重楼的高效栽培提供了一种有效的微生物菌剂，也为理解PGPR与药用植物互作机制提供了新的视角，对推动微生物菌剂在药用植物栽培中的应用具有重要意义，特别是在减少化肥使用、提高药材质量和保护濒危药用植物资源方面具有广阔的应用前景。

研究还发现，接种P6菌剂可能通过诱导系统抗性（Induced Systemic Resistance, ISR）激活植物的防御系统，从而刺激更多重楼皂苷的合成。这一发现为理解微生物-植物互作如何影响植物次生代谢提供了新的思路，也为开发既能促进生长又能提高药材质量的微生物菌剂提供了理论依据。