酶激活双锁荧光探针FC-1实现皮肤鳞状细胞癌精准成像与瘢痕疙瘩鉴别诊断

《Smart Molecules》：Enzyme-activatable dual-locked fluorescent probe for precision imaging of cutaneous squamous cell carcinoma

本刊推荐：本研究设计了一种新型双酶激活近红外荧光探针FC-1，通过同步靶向成纤维细胞活化蛋白α（FAPα）和组织蛋白酶C（CTSC），实现了皮肤鳞状细胞癌（cSCC）的高特异性成像。该探针采用"双锁"激活策略，有效避免正常组织非特异性信号，在体内外实验中均展现出卓越的区分恶性肿瘤与瘢痕疙瘩的能力，为cSCC的早期诊断和术中导航提供了创新性工具。

　　

1 引言

皮肤鳞状细胞癌（cSCC）作为第二常见的皮肤恶性肿瘤，其全球发病率呈显著上升趋势。临床诊断主要依赖医师对临床表现的判断和侵入性皮肤活检确认，尽管组织病理学仍是诊断金标准，但诸如皮肤镜、反射共聚焦显微镜（RCM）和高频超声（HFUS）等非侵入性光学技术也存在成像深度有限、时空分辨率不足、操作者依赖性等缺陷。荧光成像技术因其非侵入性、实时监测、成本效益和高灵敏度等优势，在肿瘤诊断领域展现出巨大潜力。

研究发现在上皮肿瘤中高度过表达的成纤维细胞活化蛋白α（FAPα）可作为cSCC诊断的生物标志物，但其在瘢痕疙瘩中也存在显著过表达，可能导致单锁探针产生假阳性信号。与此同时，半胱氨酸组织蛋白酶在SCC肿瘤发生中发挥关键作用，其中组织蛋白酶C（CTSC）在SCC组织中的表达水平和酶活性与正常组织存在显著异质性。基于FAPα和CTSC在正常组织与SCC中的内在差异，本研究设计了靶向CTSC和FAPα的双靶点激活"双锁"可激活荧光探针，以增强cSCC的诊断特异性。

2 结果与讨论

2.1 探针的合理设计

与单锁探针相比，酶激活双锁探针显著降低了假阳性信号的发生率，解决了生物活性物质特异性低的问题，实现了精准成像。研究人员开发了一种可被FAPα和CTSC特异性顺序激活的双酶近红外（NIR）荧光探针FC-1和FC-2。这些探针包含两个主要组成部分：选择性靶向FAPα和CTSC的识别单元（四肽Ac-Gly-Pro-Gly-Phe或Cbz-Gly-Pro-Gly-Phe）和作为荧光报告基因的近红外半花菁染料（HD-OH），通过自消除型4-氨基苄醇（PABA）间隔基连接。

在完整探针中，HD-OH的固有分子内电荷转移（ICT）过程受到抑制，导致荧光淬灭。经FAPα特异性酶切后，探针发生初始水解产生非荧光中间体Gly-Phe-PABA-HD。随后经CTSC蛋白水解激活移除二肽Gly-Phe，启动PABA间隔基的1,6-自消除级联反应。这种结构重排暴露了半花菁荧光团的羟基，在生理条件下去质子化形成给电子的酚盐阴离子，增强ICT过程，从而恢复近红外荧光发射。

2.2 探针的光谱特性

FC-1在600纳米和645纳米处呈现两个吸收峰，并在680纳米处显示弱荧光发射。在FAPα和CTSC存在下，FC-1在600纳米处的吸收峰减弱，并在690纳米处出现新的吸收峰。与FAPα和CTSC孵育后，FC-1的荧光波长红移至715纳米，强度增强11倍，表明对两种酶具有强烈的荧光响应。而当单独添加FAPα或CTSC时，FC-1的荧光强度未发生显著变化。

相比之下，FC-2在与FAPα和CTSC孵育3小时后，其吸收和荧光波长及强度仅发生轻微变化。这些结果表明，与FC-2相比，FC-1对FAPα和CTSC的反应性显著更强，这种差异可能源于FC-1和FC-2对FAPα的亲和力不同。参考探针F-1在与FAPα孵育后，其在715纳米处的荧光强度增强了19倍。

FC-1在生理温度（37°C）和pH（7.4）条件下表现出优异的稳定性，在四小时内715纳米处的荧光仅出现可忽略不计的增加（<5%）。而与FAPα和CTSC孵育后，FC-1的荧光强度呈现时间依赖性增加（4小时内约11.7倍），验证了探针的酶特异性激活。

选择性实验表明，FC-1在醌脱氢酶1（NQO1）、组织蛋白酶B（CTSB）、caspase-3、碱性磷酸酶（ALP）、芳基硫酸酯酶（ARS）、颗粒酶B（GrzB）、白三烯A4水解酶（LTA4H）等生物分子存在下仅显示最小荧光增强，证实了FC-1对同时检测FAPα和CTSC具有 exceptional 选择性。HPLC分析进一步验证了FC-1被FAPα和CTSC激活的机制，显示酶解产物HD-OH的出现。

2.3 活细胞内源性FAPα和CTSC的荧光成像

MTT测定显示，用20μM FC-1处理后，细胞活力保持在80%以上，证明该探针具有低细胞毒性和优异的生物相容性。选择小鼠来源的SCC模型SCC7细胞系评估探针在活细胞中的酶激活潜力。实时活细胞成像显示，用FC-1孵育不同时间（15、30和60分钟）的SCC7细胞在红色通道中呈现红色荧光发射，荧光强度在60分钟时达到峰值，证实FC-1能有效可视化SCC7细胞。

为确认FC-1激活依赖于FAPα和CTSC，建立了四个实验组：A组（FAPα抑制）用10μM SP13786（选择性FAPα抑制剂）预处理；B组（CTSC抑制）用20μM E-64（选择性CTSC抑制剂）预处理；C组（双重抑制）共同处理E-64和SP13786；D组（对照组）仅用FC-1处理。共聚焦成像显示仅D组呈现强烈荧光，而A-C组荧光强度显著降低，这些发现证实FC-1需要内源性FAPα和CTSC的顺序蛋白水解激活，从而允许在活细胞中对其酶活性进行时空荧光成像。

为评估FC-1区分SCC与正常细胞的能力，研究人员评估了其在SCC7和3T3-L1（小鼠成纤维细胞系）细胞中的荧光成像性能。结果显示，用FC-1孵育的SCC7细胞近红外荧光强度显著增加，而在相同实验条件下，3T3-L1细胞显示的荧光信号强度可忽略不计，证明FC-1基于差异酶活性特异性区分SCC7和3T3-L1细胞。

2.4 体内肿瘤成像

通过在BALB/c小鼠右后肢注射预培养的SCC7细胞建立皮下cSCC肿瘤模型。培养7天后进行体内荧光成像实验。通过皮下注射向左腹（指定为正常组织）和瘤内注射向右腹（肿瘤 bearing 组织）给予FC-1。结果显示，注射后肿瘤部位的荧光强度迅速增加，相对于基线水平峰值增加3.6倍，而在正常组织中检测到最小信号变化，证实FC-1在肿瘤组织内被选择性和酶激活，从而有望在临床前环境中实现cSCC的高对比度体内成像。

为确定FC-1在肿瘤组织中的激活是否依赖于FAPα和CTSC，在cSCC的BALB/c裸鼠模型中进行了药理学抑制实验。通过注射SCC7细胞在小鼠中产生皮下肿瘤，肿瘤 bearing 小鼠培养7天后再进行分析。实验组小鼠通过静脉和腹腔注射分别预先用SP13786（FAPα抑制剂）和E-64（CTSC抑制剂）处理，间隔1小时后瘤内给予FC-1。对照组在相同条件下接受PBS后瘤内给予FC-1。在9小时的观察期内进行纵向荧光成像以监测探针激活动力学。

结果显示，对照组的荧光强度迅速增加，在给药后5小时内肿瘤区域信号强度峰值增加16.4倍。相比之下，抑制剂处理组仅显示5.8倍增加。在5小时时间点，对照组的荧光信号强度是抑制剂处理组的2.8倍，表明存在统计学显著差异。这些结果共同证实FC-1的肿瘤特异性激活是由肿瘤微环境中FAPα和CTSC的酶活性介导的。

2.5 区分cSCC与瘢痕疙瘩组织

先前研究表明，与正常成纤维细胞相比，FAPα在瘢痕疙瘩成纤维细胞中显著过表达，其在瘢痕疙瘩观察到的伤口边界扩张的病理进展中起关键作用。为验证FC-1的双锁激活策略在减少非特异性瘢痕疙瘩组织激活中的作用，在cSCC和瘢痕疙瘩组织切片中对FC-1和单锁F-1进行了比较荧光成像分析。

新鲜切除的cSCC和瘢痕疙瘩组织的组织学特征通过苏木精和伊红（H&E）染色进行表征。将新鲜切除的cSCC组织和瘢痕疙瘩组织样本冷冻切片成薄片，用FC-1或F-1（20μM，1小时）处理，随后通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）成像。结果显示，用F-1孵育的瘢痕疙瘩和cSCC组织均呈现强荧光信号。相比之下，cSCC组织显示的荧光强度显著高于瘢痕疙瘩组织，突出了FC-1在肿瘤微环境中的优先激活。这些发现证实FC-1特异性靶向肿瘤相关酶活性（FAPα和CTSC），同时最大限度地减少在非恶性瘢痕疙瘩组织中的非特异性激活，与其双锁设计策略一致。

3 结论

FC-1作为一种双酶级联激活探针，旨在利用cSCC中内源性上调的FAPα和CTSC，促进cSCC的准确鉴别诊断和治疗评估。FC-1经FAPα和CTSC顺序酶切产生荧光团HD-OH，从而对cSCC相关酶活性表现出高选择性。该探针有助于小鼠cSCC肿瘤的实时体内成像，并在离体研究中可靠地区分cSCC组织与瘢痕疙瘩组织。这种"双锁"设计策略保证了FC-1在FAPα和CTSC同时存在下的特异性激活，从而能够精确区分cSCC组织和瘢痕疙瘩组织。

然而，FC-1也存在某些局限性，如相对较长的响应时间。这种延迟可能是由于串联锁设计中所需的顺序酶切激活。为克服这一问题，未来的设计可采用并行锁策略，允许任一种酶独立同时激活，从而实现更快响应。此外，体内信噪比仍然欠佳，表明需要进一步优化探针设计和性能。总体而言，这种方法在cSCC的早期特异性检测方面具有巨大的临床潜力，从而满足皮肤肿瘤学的关键需求。例如，FC-1可配制成局部给药制剂，如凝胶或微针贴剂。这些递送策略提供了非侵入性、患者友好的替代方案，可促进探针在浅表皮肤病变中的有效渗透和激活。此类制剂将进一步增强FC-1的临床适用性，支持其用于cSCC的非侵入性诊断或术中可视化。

4 实验方法

4.1 探针的合成

合成路线详情见支持信息S1：方案S1和S2。探针FC-1和FC-2的分子结构通过NMR光谱和MALDI-TOF质谱（图S4-S13）进行全面表征。

4.2 光物理性质测量

使用HEPES缓冲液（50mM，pH 7.4）获取吸收和荧光光谱。探针FC-1和FC-2的储备溶液（10mM）通过溶解在二甲亚砜（DMSO）中制备，然后在HEPES缓冲液中稀释用于分析。所有分光光度