S-氯胺酮治疗创伤后应激障碍的时间依赖性效应及其VTA-OFC多巴胺神经环路机制

本研究发现，早期而非晚期给予S-氯胺酮（S-Ketamine）可显著改善创伤后应激障碍（PTSD）模型小鼠的行为表型，尤其促进恐惧消退。研究揭示腹侧被盖区多巴胺能神经元（VTADA）在PTSD进展中兴奋性持续降低，而早期干预可逆转这一现象。VTADA-眶额叶皮层（OFC）环路介导了S-氯胺酮的疗效，靶向OFC的时序干涉无创脑刺激（TI-NIBS）可扩展治疗时间窗。该研究为优化氯胺酮辅助心理治疗提供了新策略。

　　

1 引言

创伤后应激障碍（PTSD）是一种严重的精神疾病，其特征包括创伤性事件后的侵入性记忆、创伤再体验、回避创伤提醒、负面认知和情绪以及过度警觉。目前的药物治疗如选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRI）和5-羟色胺-去甲肾上腺素再摄取抑制剂（SNRI）存在起效慢、治疗周期长和副作用等问题。氯胺酮作为一种非竞争性NMDA受体拮抗剂，因其快速的抗抑郁作用和治疗PTSD的潜力而受到关注。然而，其疗效存在争议，可能与给药时间有关。

大量证据表明，中脑多巴胺系统，特别是腹侧被盖区（VTA），在PTSD的发生和发展中起关键作用。急性应激动态改变中脑边缘多巴胺环路的神经元活动，VTA多巴胺（VTA^DA）神经元在创伤后表现出兴奋性和爆发性放电的持续降低。氯胺酮通过调节VTA^DA神经元活动和放电模式来挽救行为异常，表明这些神经元可能是缓解PTSD症状的治疗靶点。

眶额叶皮层（OFC）作为前额叶的重要子区域，接收来自VTA神经元的密集多巴胺能投射，在调节适应性行为反应，特别是恐惧消退过程中起关键作用。考虑到其功能特异性和临床可及性，OFC神经网络已成为多种精神疾病神经调节治疗的重要靶点。

本研究使用分层3D运动学习框架比较了早期（建模后24小时）和晚期（建模后7天）给予S-氯胺酮（腹腔注射10 mg kg^?1）对单次延长应激和休克（SPS&S）建模小鼠PTSD行为表型的影响。采用体内电生理学、光遗传学/化学遗传学操作和纤维光度记录等技术研究PTSD进展过程中VTA^DA神经元放电的动态变化，以及S-氯胺酮时间依赖性治疗作用的神经机制。此外，开发了靶向OFC的非侵入性时序干涉脑刺激（TI-NIBS）技术，以扩展S-氯胺酮治疗PTSD的时间窗口。

2 结果

2.1 早期而非晚期给予S-氯胺酮缓解PTSD样行为

在SPS&S建模后，小鼠在第一天（早期S-氯胺酮干预，PTSD+EK组）或第七天（晚期S-氯胺酮干预，PTSD+LK组）接受腹腔注射10 mg kg^?1 S-氯胺酮。通过高架十字迷宫（EPM）和开放场地（OFT）测试评估自发行为。结果显示，PTSD建模诱导焦虑样行为，表现为在EPM中开放臂停留时间减少和进入开放臂次数减少，在OFT中中心区域运动减少和总移动距离减少。早期和晚期S-氯胺酮干预均缓解了焦虑样行为。

使用无监督3D运动机器学习框架对自发行为进行精确量化。基于小鼠行为图谱数据库和先前研究，识别出40种运动并将其分为13种行为特征：恐惧闪回（冻结、跳跃）、探索（直立、爬升、嗅探）、警觉（凝视、爬行）、回避/焦虑（蜷缩、理毛、驼背）和运动（行走、奔跑、转弯）。PTSD建模导致探索和运动相关行为减少，恐惧闪回和回避/焦虑相关行为增加；EK干预逆转了这些行为改变，而LK干预无明显改善。

降维和无监督聚类清晰区分了PTSD+生理盐水组和No-PTSD组。PTSD+EK组的个体聚类更接近No-PTSD组，而PTSD+LK组靠近PTSD+生理盐水组。进一步分析显示，PTSD建模导致向冻结行为的转换增加81%，表明恐惧记忆闪回增强，而EK干预类似于No-PTSD组。LK干预组仍显示转换显著增加。

在恐惧记忆和消退方面，PTSD建模小鼠在恐惧消退和恐惧更新测试中表现出显著升高的冻结水平，表明恐惧消退受损。EK干预有效降低了冻结水平，而LK干预无类似效果。这些结果表明，先前的SPS&S暴露不影响恐惧记忆的初始形成，但损害恐惧消退。EK给药改善了这种损害，而LK干预未提供可比益处。

聚类分析显示两个 distinct 簇（簇1和簇2）。簇1主要由No-PTSD组主体（88.9%）组成，而簇2主要由PTSD+生理盐水组主体（88.9%）组成。统计比较恐惧记忆形成和消退期间的冻结时间比表明，簇1的恐惧反应显著低于簇2，与No-PTSD和PTSD+生理盐水组的行为表型一致。

为标准化PTSD+EK和PTSD+LK组之间的给药间隔，晚期氯胺酮干预组在匹配的早期干预时间点进行行为测试。S-氯胺酮给药组未显示行为改善，证实延迟干预无效与药物暴露间隔无关。此外，PTSD建模后6小时内给予S-氯胺酮也缓解了PTSD样行为。

2.2 PTSD进展过程中VTA^DA神经元兴奋性和放电模式的动态改变

全脑c-Fos图谱结果显示，在PTSD密切相关的脑区中，只有VTA的神经元活动在模型建立后持续降低。采用体内电生理记录监测建模前以及建模后第1天和第7天的神经元活动。为排除慢性电极植入伪影的潜在混淆，在非PTSD模型小鼠中使用相同的记录方案和时间点进行平行对照实验。

将AAV2/9-Ef1a-DIO-ChR2-mCherry转染至DAT-Cre小鼠中以特异性标记多巴胺（DA）神经元，并通过473 nm蓝光激活。20 Hz光刺激后，DA神经元被强烈激活，证实了方法的特异性。记录建模前136个神经元、建模后第1天157个神经元和建模后第7天158个神经元的自发神经活动。其中分别识别出63、49和42个DA神经元。

分析显示，建模后第1天DA神经元放电率显著降低，第7天进一步降低（基线2.204 ± 0.2258 Hz vs 后第1天1.435 ± 0.1604 Hz vs 后第7天0.7587 ± 0.07414 Hz）。相比之下，非DA神经元的放电率随时间无显著变化。爆发放电按先前描述定义。DA神经元的爆发指数（爆发事件与总峰值的比率）在建模后第1天较基线显著降低，第7天降低更明显，爆发持续时间也减少。DA神经元爆发内的峰值在第7天显著较低，而第1天与基线相比无显著差异。此外，对照小鼠在DA或非DA神经元的放电频率上未显示时间依赖性改变，并在所有间隔保持稳定的爆发动力学，证实电极植入本身未驱动进行性活动减退或相关电生理变化。VTA^DA神经元的放电率与爆发放电呈显著正相关。这些发现表明PTSD建模后DA神经元活动出现进行性、时间依赖性抑制，而非DA神经元不受影响。

2.3 早期S-氯胺酮干预通过逆转PTSD进展中VTA^DA神经元活动减退促进恐惧消退

使用体内电生理记录评估S-氯胺酮在PTSD建模后不同时间点对VTA^DA神经元活动的影响。建模后第8天，恐惧条件化开始前，PTSD+EK组的VTA^DA神经元保持持续兴奋，其放电率、爆发指数、爆发持续时间和爆发内峰值与No-PTSD组相似。相比之下，PTSD+LK和PTSD+生理盐水组的VTA^DA神经元活动较低。这些发现表明EK干预似乎维持增强的多巴胺能神经元兴奋性，而延迟干预无法产生类似效果，突出了EK干预对恢复VTA^DA功能的重要性。

具体地，通过在建模后第1天和第7天腹腔注射10 mg kg^?1 S-氯胺酮后记录30分钟，评估其即时效应。建模后第1天，结果显示氯胺酮给药后VTA^DA神经元的放电率较给药前显著增加。此外，爆发指数和爆发内峰值显著升高，表明神经元兴奋性增加。相比之下，当在建模后第7天给予相同剂量时，未观察到放电率或爆发活动的显著变化。

此外，对PTSD建模小鼠在创伤后1天和7天的VTA组织进行RNA测序（与并行处理的假对照组比较），识别出232个突触相关差异表达基因（DEG），得到基因本体（GO）在突触成分中的富集支持。随后的qRT-PCR验证显示NMDA和AMPA受体亚型在PTSD后1天短暂上调，随后在第7天恢复至基线水平。NMDA和AMPA受体表达的这些动态变化可能介导VTA^DA神经元对S-氯胺酮干预的不同反应性。

为阐明VTA^DA神经元兴奋性与恐惧消退之间的因果关系，使用DREADDs调节DAT-Cre小鼠的VTA^DA神经元。具体地，将AAV2/9-Ef1α-DIO-hM3Dq-mCherry或AAV2/9-Ef1α-DIO-mCherry双侧转染至VTA。从PTSD建模后第一天开始，连续七天腹腔注射氯氮平N-氧化物（CNO；3 mg kg^?1）。从建模后第9天到第14天进行恐惧条件化和消退测试。结果显示，在PTSD进展期间激活VTA^DA神经元不影响恐惧记忆形成，但显著促进恐惧消退，而不影响恐惧更新。

此外，通过将AAV2/9-Ef1α-DIO-hM4Di-mCherry或AAV2/9-Ef1α-DIO-mCherry转染至DAT-Cre小鼠的VTA，检查VTA^DA神经元抑制的效果。小鼠从PTSD建模后第一天开始同时腹腔注射CNO（3 mg kg^?1）和S-氯胺酮。CNO给药持续7天。结果显示，抑制VTA^DA神经元活性削弱了S-氯胺酮促进恐惧消退的效果，而不影响恐惧记忆形成和恐惧更新。这些结果共同表明VTA^DA神经元参与调节恐惧记忆的消退，但不影响恐惧更新，且EK干预通过在PTSD进展期间维持VTA^DA神经元兴奋性促进恐惧消退。

2.4 早期S-氯胺酮干预诱导VTA^DA神经元超敏反应促进恐惧消退

为检查EK干预对恐惧消退期间VTA^DA神经元活动的影响，使用纤维光度记录在体监测钙信号，同时小鼠进行恐惧消退。小鼠接受24次连续30秒CS呈现。每次CS开始前的5秒定义为CS前基线。

在恐惧消退期间，PTSD+生理盐水小鼠在CS开始时的钙活动显著低于No-PTSD小鼠。然而，EK干预恢复了VTA^DA神经元对CS的反应性，与No-PTSD组相当，表明神经元功能正常化。相比之下，LK干预未增加VTA^DA反应性，仍保持在较低水平，与PTSD+生理盐水组相似。值得注意的是，VTA^DA神经元的总体反应性在恐惧消退第二天降低。此外，观察到VTA^DA神经元兴奋性与冻结水平呈负相关。这些结果表明PTSD建模降低VTA^DA神经元对厌恶刺激的反应性。此外，EK干预增强VTA^DA神经元反应性，促进消退，而LK干预对神经元活动影响有限。这些发现与上述结果一致，表明严重应激后早期S-氯胺酮干预可更有效预防PTSD诱导的VTA^DA神经元功能下降。

为直接检查VTA^DA神经元活动与恐惧消退之间的因果关系，使用双向调节VTA^DA神经元。首先，将AAV2/9-Ef1α-DIO-ChR2-mCherry或AAV2/9-Ef1α-DIO-mCherry转染至DAT-Cre小鼠的VTA，随后植入光纤。这种病毒和转基因方法成功标记了VTA多巴胺能神经元，通过组织学分析证实。在消退训练期间CS呈现时应用光遗传学刺激（473 nm，20 Hz爆发，20 ms脉冲，持续250 ms，每5秒传递一次）。体外全细胞膜片钳记录验证该方案有效激活VTA^DA神经元。ChR2和mCherry组在恐惧记忆编码期间的冻结时间比无显著差异。然而，在CS开始时光激活VTA^DA神经元显著降低ChR2组的冻结时间比 compared to 对照组。此外，ChR2组的冻结反应在消退检索期间仍显著低于mCherry组。值得注意的是，激活VTA^DA神经元不影响恐惧记忆更新过程。

为验证激活VTA^DA神经元在早期S-氯胺酮干预中介导促进恐惧消退的必要性，在PTSD建模后第一天腹腔注射S-氯胺酮（10 mg kg^?1），随后在恐惧消退期间抑制VTA^DA神经元。进一步，将AAV2/9-Ef1α-DIO-NpHR3.0-mCherry或AAV2/9-Ef1α-DIO-mCherry转染至DAT-Cre小鼠的VTA。体外全细胞膜片钳记录显示连续594 nm黄光刺激有效抑制VTA^DA神经元活动。在CS呈现期间应用光抑制VTA^DA神经元。NpHR和mCherry组在恐惧条件化期间无显著差异。然而，VTA^DA神经元抑制导致NpHR组在恐惧消退和检索期间的冻结时间长于对照组。值得注意的是，这种光操作不影响S-氯胺酮干预诱导的促进恐惧更新能力。

2.5 早期给予S-氯胺酮激活VTA^DA-OFC挽救PTSD后恐惧消退损伤

为阐明介导恐惧消退的VTA^DA神经元下游区域功能，将AAV-mCherry注射至DAT-Cre小鼠的VTA以标记VTA^DA神经元并识别其向皮质的投射。发现在VTA^DA神经元向前额叶皮质的投射中，29.42%靶向OFC的腹外侧眶子区域。此外，使用pRV-CAG-EGFP病毒在C57小鼠的OFC注射进行逆行追踪，证明VTA中3.75%的DA神经元投射至OFC。值得注意的是，在所有投射至OFC的VTA神经元中，38.46%为DA神经元，而61.54%为非DA神经元。此外，光刺激VTA^DA神经元触发OFC中多巴胺的显著释放。

为确定激活VTA^DA-OFC通路是否能改善PTSD小鼠的恐惧消退缺陷，将AAV2/9-Ef1α-DIO-ChR2-mCherry或AAV2/9-Ef1α-DIO-mCherry转染至小鼠的VTA，随后在OFC植入光纤。这允许在恐惧消退期间光遗传学调节OFC中的VTA^DA末梢。ChR2和mCherry组在恐惧条件化期间的冻结时间无差异。然而，光刺激OFC中的VTA^DA末梢显著降低恐惧消退期间的冻结反应。这种降低在消退检索期间持续，表明激活VTA^DA-OFC回路促进PTSD小鼠的恐惧消退。

随后，为验证VTA^DA-OFC回路在S-氯胺酮促进恐惧消退中的作用，使用AAV2/9-Ef1α-DIO-NpHR3.0-mCherry转染和刺激进行特异性抑制， following 早期S-氯胺酮（腹腔注射）给药 during CS呈现。与先前发现一致，EK干预改善的恐惧消退和检索功能被抑制VTA^DA-OFC回路阻止。

为确定OFC中与VTA^DA神经元形成突触连接的具体神经元亚型，将顺行跨突触追踪剂AAV9-DIO-mWGA-Flop注射至VTA，将AAV9-FDIO-EYFP注射至DAT-Cre小鼠的OFC。免疫荧光染色显示，OFC中大多数（75.31%）顺行标记细胞与谷氨酸能（CaMKIIα阳性）神经元共定位，与GABA能（GABA阳性）神经元的共定位 minimal（33.43%）。为特异性光遗传学操作VTA^DA-OFC^CaMKII通路，将AAV9-DIO-mWGA-Flop注射至VTA，将AAV9-CaMKII-ChR2-FDIO-EYFP或AAV9-CaMKII-eNpHR-FDIO-EYFP注射至DAT-Cre小鼠的OFC。在消退训练期间光遗传学激活此通路显著挽救PTSD模型小鼠的恐惧消退缺陷。相反，抑制该通路损害S-氯胺酮的功效，证明其对于药物行为效应的必要性。这些结果共同证明EK干预通过激活VTA^DA-OFC^CaMKII促进恐惧消退。

2.6 TI-NIBS增强OFC多巴胺释放扩展S-氯胺酮治疗PTSD的时间窗口

鉴于S-氯胺酮的给药时间重要性，研究结合LK干预与TI刺激（一种新兴的非侵入性脑刺激技术）是否能扩展S-氯胺酮治疗PTSD的时间窗口。在PTSD建模后第7天腹腔注射S-氯胺酮，同时向OFC应用20分钟TI-NIBS（150 μA，20 Hz）。为验证TI-NIBS是否特异性激活OFC中的神经元，TI-NIBS后进行免疫荧光染色以量化c-Fos表达（一种立即早期基因和神经元激活标志物）。结果显示TI-NIBS特异性增加OFC中的神经元活动，而相邻区域显示 minimal 或非特异性激活。

为监测氯胺酮给药和TI刺激期间OFC中DA释放的实时变化，将GRABDA3.0病毒注射至OFC。LK干预与TI-NIBS结合显著增强OFC中的多巴胺释放，证明这种增强治疗效果的潜在机制。

进行一系列行为评估以检查这种联合干预的效果。首先，与LK+No-TI组小鼠相比，接受LK干预结合TI-NIBS（LK+TI组）的小鼠显示恐惧闪回的行为概率显著降低，探索相关行为增加。此外，TI-NIBS显著减少向冻结的自发运动转换（LK+No-TI 10.7 ± 0.8074 vs LK+TI 6.595 ± 0.5107 vs EK+No-TI 5.784 ± 0.55）。这些治疗效果与EK干预组观察到的相当。无监督聚类进一步证明LK结合TI刺激与EK干预更密切相关。恐惧条件化测试结果显示这种联合修改显著改善恐惧消退，而LK干预 alone 无法诱导。与先前关于激活VTA^DA-OFC通路的发现一致，TI刺激未改变恐惧更新测试中的冻结反应。总体，这些发现表明TI刺激成功敏化神经元对S-氯胺酮的反应，并在S-氯胺酮晚期给药时恢复PTSD的治疗效果。

为进一步研究TI-NIBS alone 对恐惧消退缺陷的影响，小鼠在SPS&S建模后第7天腹腔注射生理盐水后立即接受TI-NIBS（生理盐水+TI组）。结果显示TI-NBS alone（生理盐水+TI组）部分缓解PTSD模型中的恐惧消退缺陷。然而，这种效果显著弱于LK+TI组（晚期氯胺酮+TI刺激）。这些结果表明在PTSD晚期，虽然TI-NBS有助于挽救，但最佳功效需要S-氯胺酮的协同增强。

3 讨论

本研究调查了S-氯胺酮对PTSD样行为的时间依赖性治疗作用及其潜在神经机制。观察到在PTSD进展期间早期S-氯胺酮给药显著缓解异常自发行为和恐惧消退缺陷，而晚期S-氯胺酮给药仅部分减轻焦虑样行为。具体地，VTA^DA神经元在PTSD建模后显示放电率和爆发率的连续降低，早期S-氯胺酮干预可恢复此现象，但晚期干预不能。特别是，VTA^DA神经元对条件刺激反应，介导恐惧消退期间厌恶记忆编码与原始条件信息的替换。通过光遗传学/化学遗传学操作选择性抑制VTA^DA-OFC神经回路中断了基于S-氯胺酮的PTSD治疗。靶向OFC的TI-NIBS可扩展S-氯胺酮的治疗时间窗口，使得如果错过PTSD治疗的最佳时期仍能保留疗效。

使用氯胺酮治疗PTSD是近期临床研究的主要焦点。多项研究显示其对PTSD症状的快速且强大效果，包括侵入性记忆、回避行为、过度警觉和高度焦虑、恐惧消退。这些症状改善可在几小时内发现并持续长达28天，与选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRI）如帕罗西汀、舍曲林和氟西汀的延迟效果形成对比，后者可能需要数周或数月才能实现部分缓解。然而，氯胺酮治疗PTSD有一些局限性。例如，在涉及军事人员和烧伤患者的试验中，氯胺酮未能降低PTSD的长期患病率。值得注意的是，氯胺酮辅助心理治疗（KAP）在心理治疗之前、期间或之后的给药时间导致异质性精神病学结果。这些现象表明给药时间可能对氯胺酮的治疗功效至关重要。

作为一种具有快速情绪调节作用的精神活性物质，一个未解决的问题是：用氯胺酮治疗PTSD依赖于早期干预以预防症状发展，还是在异常精神病发作时直接行为修改？为解决这个问题，首先需要清晰阐述整个PTSD进展过程中中枢神经系统的动态变化。中脑VTA多巴胺能信号功能障碍导致PTSD症状。此外，脑区如杏仁核、海马和前额叶皮层中的多巴胺合成和传输异常与受损恐惧记忆处理相关，恢复适当的多巴胺信号可缓解PTSD症状。改变的VTA^DA神经元活动与PTSD密切相关，其特征是爆发性放电的持续降低，通常导致 robust 多巴胺释放。在当前研究中，证明PTSD建模导致神经元活动的进行性抑制，整体放电率和爆发放电率逐渐下降。这种VTA^DA神经元兴奋性的持续降低被认为是应激后PTSD发展的关键因素。

VTA^DA神经元的兴奋性和放电模式由各种受体、离子通道和相关神经回路决定。例如，HCN、SK2和NMDA受体介导应激后神经元活动内在调节器的 disruption。Kv4.3和BKCa1.1差异影响强化和消退学习期间多巴胺神经元放电和多巴胺释放的动力学。此外，PTSD诱导的突触传输和可塑性缺陷与NMDA受体功能减退密切相关，通过此NMDA受体（NMDAR）可塑性代表对环境刺激的条件多巴胺神经元爆发反应的潜在神经底物。此外，外侧缰核作为反奖赏中心，在应激后激活并通过长投射抑制VTA^DA神经元。此外，星形胶质细胞可通过调节轴突神经调节剂（包括GABA和腺苷）的细胞外张力来调节多巴胺传输。

在当前研究中，当从PTSD发作早期通过化学遗传学操作反复增强VTA^DA神经元活动时，PTSD样行为显著改善。相反，化学遗传学抑制VTA^DA神经元减弱了S-氯胺酮改善PTSD症状的治疗效果。值得注意的是，只有当VTA^DA神经元超活跃时（PTSD建模后24小时），S-氯胺酮给药才增强其兴奋性和爆发放电。近期证据显示氯胺酮的功能是活动依赖性的，需要目标区域本质活跃且具有开放NMDARs。同时，氯胺酮对神经元兴奋性的 prolonged 调节作用可能 due to 使用依赖性 trapping of 氯胺酮 in NMDARs，使受体活跃更长时间，或通过增强突触可塑性和神经回路功能。RNA测序和qRT-PCR数据也显示大多数NMDA受体（NMDAR）和AMPA受体（AMPAR）亚基的表达在创伤后第1天短暂上调，随后在第7天恢复至基线水平。值得注意的是，GluN2B，突触可塑性和长时程增强（LTP）的关键介导者，符合此时间模式。相反，NMDA受体可塑性的丧失（如GluN2B下调）在创伤后第7天可能解释延迟S-氯胺酮给药的 diminished 治疗功效。这些发现提供潜在分子证据 linking PTSD进展与受损VTA^DA神经元可塑性。确实，尽管氯胺酮的作用机制超越NMDARs（如GABA能和