CCL5hi巨噬细胞通过CCL5-CCR5轴增强食管鳞癌免疫化疗疗效的机制研究

本文揭示了食管鳞癌（ESCC）免疫化疗（PD-1阻断联合化疗）中CCL5hi巨噬细胞通过CCL5-CCR5轴激活CD8+T细胞的关键作用。研究发现Stat1转录调控CCL5表达，形成IFN-γ-Stat1-CCL5正反馈环路，为优化患者分层和联合治疗策略提供了新靶点。

　　

2.1 CD8⁺T细胞和巨噬细胞在ESCC患者NICB治疗中起关键作用

通过对31例接受新辅助PD-1阻断（卡瑞利珠单抗）联合化疗（白蛋白紫杉醇+卡培他滨）的ESCC患者肿瘤组织进行RNA测序分析，发现应答组（R）治疗后CD8⁺T细胞浸润比例显著增加（P<0.05），而无应答组（NR）无显著变化。多重荧光免疫组化（mfIHC）显示，应答组中CD8⁺T细胞与CD68⁺巨噬细胞在空间上紧密相邻（距离<20μm），提示二者存在相互作用。

小鼠体内实验证实，联合治疗（抗PD-1+白蛋白紫杉醇）显著抑制肿瘤生长（P<0.05）。RNA-seq分析显示，联合治疗组中干扰素-γ（IFN-γ）应答、T细胞增殖正调控、PD-L1表达等通路显著富集。免疫染色进一步验证CD8⁺T细胞和巨噬细胞浸润增加，且M1型标志物（如IFN-γ）上调，M2型标志物（如CD163）下调。

2.2 巨噬细胞耗竭降低免疫化疗疗效

采用氯膦酸盐脂质体或抗CSF1R抗体耗竭巨噬细胞后，联合治疗的抗肿瘤效果显著减弱（P<0.05）。流式细胞术和免疫荧光显示，巨噬细胞耗竭组中F4/80⁺CD11b⁺巨噬细胞和CD8⁺T细胞数量均减少，证实巨噬细胞对维持CD8⁺T细胞活性和治疗效果至关重要。

2.3 单细胞RNA测序揭示CCL5^hi巨噬细胞亚群

对免疫化疗处理的小鼠肿瘤CD45⁺细胞进行单细胞RNA测序（scRNA-seq），UMAP分析鉴定出5个巨噬细胞亚群。其中Macrophage 1、3、5在联合治疗组比例显著升高，差异表达分析显示CCL5是这些亚群中最显著上调的基因。这三个亚群被统称为CCL5^hi巨噬细胞，其M1型相关标志物（如CD86）表达升高，M2型标志物（如CD206）降低。

CellChat分析发现，联合治疗组中CCL5^hi巨噬细胞与CD8⁺效应T细胞之间存在6对显著配体-受体互作，其中CCL5-CCR5互作最强。流式分选验证CCL5^hiCD11b⁺F4/80⁺细胞在联合治疗组中比例增加。

2.4 CCL5^hi巨噬细胞与CD8⁺T细胞相互作用

scRNA-seq相关性分析显示，巨噬细胞表面蛋白Ly6a与CCL5表达高度正相关。流式分选Ly6a⁺CD11b⁺F4/80⁺细胞证实联合治疗组CCL5表达升高。

功能实验表明，与联合治疗组来源的Ly6a⁺巨噬细胞共培养后，CD8⁺T细胞中效应细胞（CD8⁺CD44⁺CD62L^-）比例显著增加。利用siRNA敲低RAW264.7细胞中CCL5后，共培养的CD8⁺T细胞增殖、活化和趋化能力均减弱。补充重组CCL5蛋白可逆转上述效应，而CCR5阻断剂Leronlimab能抑制CCL5介导的ERK通路磷酸化（c-RAF、P90RSK、ERK），证实CCL5-CCR5轴的关键作用。

体内实验显示，抗CCL5抗体处理削弱了联合治疗的疗效，肿瘤中CD8⁺T细胞浸润和多功能细胞（CD8⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺）比例降低。

2.5 Stat1转录上调CCL5

scRNA-seq相关性分析发现，巨噬细胞中Stat1与CCL5表达正相关性最强（r=0.29）。TCGA_ESCA数据集验证CCL5与Stat1RNA水平显著相关（r=0.575）。过表达Stat1可上调293FT和NIH3T3细胞中CCL5表达，而敲低RAW264.7细胞中Stat1则降低CCL5RNA和蛋白水平。

JASPAR预测和ChIP实验证实Stat1可直接结合CCL5启动子区域（-1464~-1454bp）。IFN-γ处理诱导RAW264.7细胞Stat1蛋白表达上调，且联合治疗组肿瘤中IFN-γ水平升高（P=0.02），提示IFN-γ-Stat1通路参与CCL5调控。

2.6 CCL5^hi巨噬细胞的临床意义

多个公共数据集（GSE91061、PRJEB23709等）分析显示，黑色素瘤、胃癌、非小细胞肺癌患者应答组肿瘤组织中CCL5表达更高。TCGA数据中CCL5高表达与黑色素瘤患者更好生存相关。SYSUCC队列中，应答组治疗前肿瘤CCL5⁺巨噬细胞浸润评分更高。

mfIHC显示，ESCC患者治疗前活检组织中，应答组的CD68⁺Stat1⁺巨噬细胞更靠近肿瘤细胞（距离<50μm）和CD8⁺T细胞（距离<20μm）。小鼠实验中补充重组CCL5蛋白进一步增强联合治疗效果，肿瘤CCL5水平及CD8⁺T细胞浸润显著增加。

3 讨论

本研究通过多组学分析揭示了ESCC免疫化疗中CCL5^hi巨噬细胞的核心作用。该亚群通过Stat1介导的CCL5转录上调，与CD8⁺T细胞形成CCL5-CCR5正反馈环路，增强T细胞活化和肿瘤杀伤。临床数据验证CCL5^hi巨噬细胞与治疗应答和患者生存正相关，为生物标志物开发和联合治疗策略（如CCL5补充）提供了理论依据。

4 实验方法

研究涉及人类ESCC组织样本、小鼠移植瘤模型、体外细胞共培养、scRNA-seq、流式细胞术、Western blot、ChIP、ELISA等多种技术，详细实验条件见原文方法部分。