去甲替尼通过靶向HOXA1-PITX2相分离抑制胃癌进展中溶酶体胞吐介导的SASP

本研究揭示了去甲替尼（Nor）通过破坏HOXA1与PITX2的相分离（LLPS），抑制溶酶体胞吐关键基因MCOLN1和RAB3A的表达，进而阻断衰老相关分泌表型（SASP）因子（如LGALS1和IGFBP7）的释放，最终抑制AKT信号通路活化、上皮-间质转化（EMT）及胃癌的肿瘤发生与侵袭，为靶向SASP的胃癌治疗提供了新策略。

　　

1 引言

胃癌是一种高度侵袭性的恶性肿瘤，是全球癌症相关死亡的第二大原因。尽管在过去50年中，由于成功治疗幽门螺杆菌感染，其死亡率有所下降，但晚期胃癌患者的五年生存率仍然处于令人沮丧的低水平，这主要是由于复发或转移事件。研究表明，衰老相关分泌表型（SASP）在肿瘤发生中发挥重要作用，包括细胞因子、生长因子、胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBPs）等可溶性因子。其中，IGFBP7通过调节胰岛素、胰岛素样生长因子或激活素A信号通路传播MSC的衰老。然而，SASP以环境依赖的方式发挥强大的促肿瘤或抑瘤功能。例如，SASP因子IL-6和IL-8促进上皮-间质转化（EMT）和癌前细胞的侵袭潜力。炎症驱动的SASP在癌症相关成纤维细胞中增强胃癌的腹膜播散。然而，胃癌恶性进展过程中SASP的调控机制和靶向策略需要全面阐明。

溶酶体胞吐是一种钙离子依赖的分泌过程，促进促进癌症进展的货物释放，但其调控通路和治疗策略了解甚少。溶酶体胞吐涉及溶酶体与质膜（PM）的融合，导致酶或代谢物的细胞外释放。一旦溶酶体沿微管从核周区域运输到细胞外围，粘脂蛋白1（MCOLN1）介导的钙离子（Ca²⁺）释放触发管腔内容物的胞吐，介导PM修复、细胞外基质重组或吞噬清除。此外，溶酶体胞吐依赖于溶酶体相关膜蛋白1（LAMP1），其敲低抑制溶酶体与PM的对接。值得注意的是，癌细胞利用溶酶体胞吐的失调来获得生存优势、基质侵袭、促转移播散或多药耐药。在胰腺导管腺癌中，肌醇多磷酸-4-磷酸酶II B过表达驱动溶酶体上磷脂酰肌醇3,5-二磷酸的产生，促进MCOLN1介导的Ca²⁺释放和溶酶体胞吐，被劫持以增强细胞运动和侵袭性。跨膜蛋白106B调节溶酶体基因的表达，并促进肺癌进展所需的组织蛋白酶溶酶体胞吐。这些研究表明，溶酶体胞吐的失调代表了癌症的新兴治疗脆弱性。

在当前研究中，我们确定配对样同源域2（PITX2）是溶酶体胞吐基因MCOLN1和RAS相关蛋白Rab-3A（RAB3A）的重要转录协调者，这与胃癌的不良结局相关。值得注意的是，PITX2在血清剥夺诱导的衰老细胞中促进SASP，导致细胞内游离钙离子增加，随后溶酶体顺行运动和PM融合，促进溶酶体胞吐、侵袭性增殖、迁移和胃癌细胞的播散。值得注意的是，血清剥夺触发同源框A1（HOXA1）与PITX2在液体凝聚物中的直接相互作用，导致PITX2活性和溶酶体胞吐增加。临床前，去甲替尼（Nor）给药阻断HOXA1与PITX2的相互作用，并抑制溶酶体胞吐、肿瘤形成和侵袭行为，强调了HOXA1/PITX2轴在溶酶体胞吐介导的SASP和癌症进展中的功能。

2 结果

2.1 PITX2促进胃癌中溶酶体胞吐必需的基因表达

为探索应激条件下癌症进展的关键调控因子，进行了转录组分析，鉴定出在血清剥夺（SD）处理的胃癌AGS细胞中1220个上调和967个下调的基因（倍数变化>2，p<0.05）。基因集富集分析（GSEA）表明，这些基因在与溶酶体腔或胞吐相关的通路中显著富集。综合分析确定PITX2是基于靶基因数量的溶酶体胞吐的顶级转录调控因子。Kaplan-Meier Plotter数据库分析表明，PITX2表达升高的胃癌患者总体生存率和无事件生存率降低。在已建立的胃癌细胞系中发现PITX2表达升高。为检查PITX2在调控溶酶体胞吐必需基因表达中的作用，选择AGS、MKN-45（相对低PITX2表达）、HGC-27和SNU-1（相对高PITX2表达）细胞作为模型。值得注意的是，稳定异位表达或沉默PITX2导致MCOLN1或RAB3A转录水平升高或降低，但不影响其他基因。染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR、双荧光素酶报告基因和western blot分析表明，在稳定转染PITX2或针对PITX2的短发夹RNA（sh-PITX2）的AGS、MKN-45、HGC-27或SNU-1细胞中，PITX2在MCOLN1或RAB3A启动子区域的富集、其转录活性和MCOLN1或RAB3A蛋白水平在CM或SD条件下升高或降低。此外，在CM或SD条件下，强制过表达或沉默PITX2导致AGS和HGC-27细胞中衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）阳性/EdU阴性染色率和异染色质蛋白1γ（HP1γ）阳性异染色质病变减少或增加。PITX2的异位表达阻止了 prolonged SD处理的AGS细胞中衰老标志物（P16和P21）的上调。这些发现表明，PITX2作为转录因子，增加胃癌中溶酶体胞吐相关基因的水平。

2.2 PITX2通过上调MCOLN1和RAB3A促进衰老胃癌细胞的溶酶体胞吐

由于MCOLN1和RAB3A有助于溶酶体胞吐必需的Ca²⁺释放和运输，我们进一步确定PITX2是否影响衰老胃癌细胞的生物学特性。在SD条件下，持续过表达或沉默PITX2显著增强或降低细胞内钙浓度和溶酶体数量或顺行运输距离，这些效应被粘脂蛋白特异性合成抑制剂3（ML-SI3）或激动剂1（ML-SA1）逆转。与MCOLN1在自噬调控中的作用一致，在稳定过表达或沉默PITX2的AGS或HGC-27细胞中，自噬流显著减少或增加， evidenced by 自溶酶体的减少或积累，以及自噬体、微管相关蛋白1轻链3（LC3）I/II和sequestosome 1（SQSTM1）水平的增加或减少，这些效应被ML-SI3或ML-SA1处理消除。同时，敲低自噬相关5（ATG5）导致AGS细胞中溶酶体顺行运输距离和PM上LAMP1表达增加。在Lyso-Tracker Red染色实验中，RAB3A敲低也消除了PITX2过表达的AGS细胞中溶酶体顺行运输的增强。此外，稳定过表达或沉默PITX2促进或抑制SD条件下AGS和HGC-27细胞中LAMP1在PM附近的定位。这种效应被溶酶体胞吐抑制剂（vacuolin-1）或激活剂（ionomycin）减弱。透射电子显微镜显示，稳定转染PITX2的AGS细胞中PM附近溶酶体数量增加，vacuolin-1逆转了这一效应。值得注意的是，与之前的研究一致，vacuolin-1处理诱导液泡形成而不改变细胞内钙水平。Western blot分析进一步证明，稳定异位表达或沉默PITX2导致AGS和HGC-27细胞PM上LAMP1表达升高或降低，这些效应被vacuolin-1或ionomycin消除。挖掘Kaplan-Meier Plotter数据库发现，MCOLN1、RAB3A或LAMP1的上调与胃癌患者不良的总体或无事件生存相关。这些发现表明，PITX2通过上调MCOLN1和RAB3A增强衰老胃癌细胞的溶酶体胞吐。

2.3 PITX2通过溶酶体胞吐介导的SASP驱动胃癌的肿瘤发生和侵袭性

随后，我们通过定量蛋白质组学分析探索了与PITX2诱导的溶酶体胞吐相关的基本蛋白质组成。响应SD处理，质谱鉴定了稳定过表达PITX2的AGS细胞培养基中715个上调和175个下调的蛋白质，这些蛋白质被vacuolin-1处理减少或增强。与SASP Atlas数据库和已报道的分泌组的全面重叠分析确定了248个上调和94个下调的候选物，涉及磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）信号、囊泡介导的运输或IGFBP信号，包括galectin-1（LGALS1）和IGFBP7。值得注意的是，LGALS1和IGFBP7水平升高与胃癌患者的不良生存预后相关。酶联免疫吸附测定（ELISA）证实，在稳定转染PITX2的AGS细胞培养基中，LGALS1和IGFBP7水平在SD条件下增加，vacuolin-1处理消除了这一效应。与LGALS1和IGFBP7在促进AKT磷酸化和EMT中的作用一致，用来自衰老AGS细胞稳定过表达PITX2的培养基处理导致AGS细胞中p-AKT³⁰⁸和p-AKT⁴⁷³水平增加，以及间质标志物（N-钙黏蛋白或Vimentin）的上调，同时上皮标志物（E-钙黏蛋白）减少。这些效应被vacuolin-1处理以及针对LGALS1或IGFBP7的中和抗体减弱。此外，用来自衰老细胞稳定过表达PITX2的培养基孵育增强了AGS细胞的增殖和侵袭潜力，这在用vacuolin-1和针对LGALS1或IGFBP7的中和抗体处理后被抵消。在裸鼠中，施用来自衰老AGS细胞稳定过表达PITX2的培养基显著促进了AGS来源的异种移植瘤的生长、重量、LGALS1和IGFBP7分泌、Ki-67增殖指数和CD31阳性微血管，伴随着AKT磷酸化和EMT标志物水平的改变，这些效应被vacuolin-1注射逆转。在实验性转移实验中，通过尾静脉施用来自稳定过表达PITX2的衰老细胞的培养基促进了AGS细胞在无胸腺裸鼠中的肺转移，导致生存率降低，vacuolin-1处理减弱了这一效应。相反，施用来自稳定沉默PITX2的衰老HGC-27细胞的培养基抑制了体内癌细胞的肿瘤形成和侵袭性。这些发现表明，PITX2通过溶酶体胞吐介导的SASP促进胃癌的肿瘤发生和侵袭性。

2.4 HOXA1与PITX2相互作用促进胃癌细胞中溶酶体胞吐相关基因表达

为研究胃癌中PITX2功能的关键结合伙伴，我们对公共数据库进行了全面分析，包括HuRI、InBioMap、BioGRID和IID。这一分析揭示了三个一致的PITX2相互作用者，其中两个与胃癌患者的不良生存结局相关。通过共免疫沉淀（co-IP）和蛋白质免疫印迹验证，PITX2内源性