温和光热双金属介孔纳米酶触发免疫原性细胞死亡与免疫微环境重塑实现精准肝细胞癌治疗

本文推荐一种新型铂钴（Pt/Co）双金属介孔纳米酶（BNzyme），其兼具类过氧化物酶（POD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性，可催化H2O2生成活性氧（ROS）并消耗谷胱甘肽（GSH），在近红外（NIR）激光照射下产生温和光热效应（42–45°C）进一步增强酶活，诱导免疫原性细胞死亡（ICD），释放肿瘤相关抗原（TAAs）和损伤相关分子模式（DAMPs），促进树突状细胞（DC）成熟和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）浸润，联合免疫检查点抑制剂（αPD-L1）重塑免疫抑制微环境（TME），显著抑制肿瘤生长和肺转移，为肝细胞癌（HCC）免疫治疗提供新策略。

　　

1 引言

肝细胞癌（HCC）的临床治疗面临严峻挑战，其低生存率与肿瘤免疫逃逸机制密切相关。尽管基于T细胞激活的免疫疗法展现出革命性潜力，但高度免疫抑制的肿瘤微环境（TME）和不足的肿瘤免疫原性严重限制了其疗效。研究发现，免疫治疗反应有限主要归因于三大障碍：抗原呈递不足导致免疫激活信号弱；TME中免疫抑制细胞因子和代谢物（如IL-10、TGF-β1和谷胱甘肽GSH）异常积累，损害免疫细胞功能；以及过度表达的免疫检查点导致T细胞耗竭。在此背景下，免疫原性细胞死亡（ICD）成为克服这些限制的关键策略。ICD通过释放肿瘤相关抗原（TAAs）、损伤相关分子模式（DAMPs）和促炎细胞因子，重塑免疫微环境，激活系统性抗肿瘤免疫。然而，有效的ICD诱导依赖于对肿瘤氧化应激水平的精确调控。

近期研究将活性氧（ROS）确定为ICD启动的关键因素，但其生成效率受TME中动态氧化还原平衡的限制。肿瘤细胞利用高水平的GSH生成和其他抗氧化防御来维持远超产生率的ROS清除能力，显著降低了常规治疗的氧化细胞毒性。因此，开发能够同时增强ROS生成和破坏抗氧化防御的纳米催化材料成为研究焦点。许多纳米酶已被证明可作为天然催化剂的模拟物。基于金属或金属氧化物的纳米酶的多酶催化特性（如类过氧化物酶POD、类过氧化氢酶CAT和类谷胱甘肽过氧化物酶GPx活性）和环境适应性引起了关注。单金属纳米酶（SNzymes）可通过级联反应放大氧化应激，增加ROS水平的同时消耗GSH。然而，其催化效率对于临床应用仍不理想，需要催化剂设计创新以优化酶性能。

与SNzymes相比，双金属纳米酶（BNzymes）具有明显优势。将多种金属纳入纳米酶结构可增强催化性能、稳定性和多功能性。值得注意的是，多金属系统固有的高稳定性赋予其卓越的耐久性以及出色的催化特性，使其在癌症治疗应用中非常有效。铂（Pt）基纳米酶因其卓越的类酶活性和稳定性而被广泛研究。此外，Pt的光热效应有利于调节酶反应温度，但Pt的稀缺性和高成本阻碍了临床转化。使用廉价金属合成Pt基双金属纳米材料是一种合理策略，不仅可以减少Pt的使用，还能提高催化性能。近期研究表明，Pt基双金属合金可通过配体效应（电子结构调控）和应变效应（晶格收缩）克服单金属催化剂的局限性，微调Pt表面的d带占据，从而优化氧中间体的吸附强度。其中，铂钴（Pt-Co）合金在电化学领域表现出优异的氧还原反应活性和稳定性，为开发有效的ICD诱导剂提供了一个有前景的平台。

2 结果与讨论

2.1 Pt/Co BNzyme的合成与表征

根据先前的合成方法，表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）既作为封端配体，又作为形态导向剂。它通过其羰基氧和内酰胺（吡咯烷酮）环与新生颗粒表面配位，选择性地钝化某些晶面。由此产生的晶面依赖性结合驱动各向异性生长，原子被纳入，引导结构向具有固有孔隙率的分支、支化架构演化。因此，Pt和Co晶体在表面活性剂上通过连续还原反应逐渐生长，最终形成双金属介孔纳米酶（BNzyme）。透射电子显微镜（TEM）显示Pt/Co BNzyme具有均匀的分散性和球形形态。还制备了Pt/Mn和Pt/Fe双金属合金纳米结构，但TEM显示与Pt/Co相比，这两种纳米材料的介孔结构不太明显，导致比表面积较小。通过高角度环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）确定的Pt/Co BNzyme元素分布显示，Pt和Co掺杂在一起并均匀分散在球形结构中。动态光散射（DLS）数据表明，Pt/Co BNzyme在ddH₂O中的平均尺寸约为62±2 nm，在PBS和盐水溶液中的直径相似。Pt/Co BNzyme进一步分散在ddH₂O中，其尺寸和PDI在一周内没有显著变化，表明良好的长期稳定性。值得注意的是，Pt/Co BNzyme表面的zeta电位为-11±0.95 mV，有利于血液循环中的稳定性。通过X射线衍射（XRD）分析了BNzyme的晶体结构。Pt物种在39.8°（111）和46.2°（200）处形成两个尖锐的金属衍射峰，表明良好的结晶度。存在两种Co晶体，导致形成CoO物种（在36.5°（111）和42.9°（200））和Co₃O₄物种（在18.8°（111）和36.8°（311））的衍射峰。通过氮吸附-脱附试验检测了Pt/Co BNzyme的介孔特性。在相对压力（P/P₀）范围0.7–0.95出现滞后回线，表明具有大的多孔比表面积（S = 109.509 m² g^?1）。此外，BNzyme的孔径约为3.73 nm，为酶反应提供了许多活性位点。最后，采用X射线光电子能谱（XPS）确定了Pt/Co BNzyme中元素和化合物的组成。532 eV处的O 1s峰表明Pt/Co中存在氧化物物种。781.2和796.5 eV处的信号分别归属于Co 2p_3/2和Co 2p_1/2轨道。Co²⁺与Co³⁺的比例约为3:1。当使用单一的Pt/Cu前体时，仅获得介孔Pt纳米颗粒。此外，多孔Pt/Co的晶格条纹横跨臂延伸而没有明显的相分离，表明Pt和Co良好混合。因此，对于Pt/Co的制备，由于Pt前体的高氧化还原电位，应在最初阶段优先还原形成Pt核，然后部分Co²⁺被还原，Co(Asc)₂·xH₂O同时并入Pt/Co合金中。随后，在生物应用前于200°C热处理12小时，在合金化纳米催化剂中形成Co²⁺和Co³⁺。Co²⁺可以催化高浓度H₂O₂生成羟基自由基（·OH），而Co³⁺可以将GSH氧化为GSSG。类似地，Pt 4f光谱中70.8和74.3 eV处的两个峰索引为Pt⁰。总之，这些发现证明了Pt/Co BNzyme的成功合成，并表明其具有多酶特性的潜力。

2.2 Pt/Co BNzyme的酶活性和光热效应

根据Pt/Co BNzyme的组成，我们推测其具有类POD和类GPx的酶活性。TMB溶液（无色）可被·OH氧化成oxTMB（蓝色）。如图所示，TMB + H₂O₂（5 mM）溶液没有颜色。然而，当向溶液中加入Pt/Co BNzyme时，颜色变为蓝色。在水浴加热（43°C）下，颜色变得更深，表明产生了更多氧化的TMB（oxTMB）。此外，（UV-vis）吸光度表明类POD酶活性是时间依赖性的，随着时间的推移产生更多·OH。652 nm处oxTMB的吸光度（OD₆₅₂）表明了Pt/Co BNzyme产生·OH的能力。此外，温和的温度加速了这一过程并产生了更多·OH。而且，为了进一步验证类POD活性，我们进行了电子顺磁共振（EPR）测试，进一步证明温和的热处理可以显著提高类酶活性。我们还测量了将Pt/Co与不同浓度的TMB孵育不同时间后的OD₆₅₂。从OD₆₅₂与时间的校准（标准）曲线中，我们确定了斜率；同时，通过应用比尔-朗伯定律，对Pt/Co与TMB进行了动力学分析，结果与米氏模型非常吻合。有意义的是，根据Lineweaver-Burk双倒数曲线拟合了最大初始速度（V_max）和米氏常数（K_m）。如图所示，K_m计算为0.97 mM，V_max确定为1.94 × 10^?7 M s^?1；这些值显著大于报道的FePt基纳米催化剂的值，进一步表明Pt/Co具有令人满意的类POD活性。使用Ellman试剂（5,5′-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)，DTNB）证实了GSH的消耗。无色的DTNB与GSH的游离巯基反应产生2-硝基-5-硫代苯甲酸（TNB），一种在412 nm处具有特征吸光度的黄色发色团（OD₄₁₂）。在对照组中，将5 mM GSH与DTNB混合产生强烈的黄色。相反，在存在Pt/Co BNzyme和H₂O₂的情况下，GSH通过类GPx催化循环被消耗，从而减少了与DTNB反应的游离硫醇量，导致黄色强度减弱。此外，升高温度（43°C）增加了这种活性，从而消耗了更多GSH。与类POD活性类似，类GPx酶活性也是时间依赖性的。OD₄₁₂结果证明了Pt/Co BNzyme的温度和时间依赖性类GPx酶活性。最后，验证了Pt/Co BNzyme的光热转换效应。在808 nm NIR激光照射下，与水溶液相比，BNzyme溶液的温度显著升高。随着照射时间和激光强度的增加，温度持续升高。为了准确测定光热转换效率（η），我们跟踪了Pt/Co系统在重复激光开/关循环下的温度上升和衰减。使用既定公式，η确定为约47.3%，该值与报道的等离子体Pt超结构的值相当。根据这些结果，通过控制激光照射的强度和时间，我们可以获得温和的温度（43°C）以实现Pt/Co BNzyme合适的酶反应条件。这种介孔BNzyme不仅催化H₂O₂产生细胞毒性ROS，还消耗GSH并诱导温和的热效应，从而增加了氧化状态。最后，我们评估了Pt/Co BNzyme的生物降解性。双金属纳米酶在体内无法有效降解可能导致随时间积累，可能引起毒性或免疫反应。TEM显示，Pt/Cu BNzyme在高H₂O₂浓度的肿瘤微环境中逐渐解体，并在24小时内完全降解。因此，我们开发的Pt/Co合金纳米催化剂不仅显示出卓越的肿瘤特异性类酶能力，而且表现出高生物安全性，使其成为临床转化中有前途的候选纳米药物。

2.3 Pt/Co BNzyme的体外抗肿瘤效果

基于上述BNzyme的特性，我们进行了体外抗肿瘤实验。将不同浓度的Pt/Co BNzyme与肿瘤（Hepa1-6）和正常（BNL CL.2）细胞孵育。即使在高浓度（400 μg mL^?1）下，仍有近92.3%的细胞存活，表明BNzyme固有的低细胞毒性。令人鼓舞的是，在BNL CL.2细胞中，即使 under laser irradiation，与Pt/Co共培养后仅检测到痕量水平的ROS生成，进一步证实了其优异的生物安全性。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察Hepa1-6细胞对FITC标记的Pt/Co BNzyme的摄取。随着时间的推移，肿瘤细胞中出现更多绿色荧光。这些细胞随后被消化并通过流式细胞术进行分析。这些结果与CLSM结果一致，表明BNzyme被这些细胞有效内化。通过CCK-8 assay检测了Pt/Co BNzyme抑制肿瘤生长的能力。单独的Pt/Co BNzyme或H₂O₂不会伤害肿瘤细胞。然而，加入H₂O₂后，Pt/Co BNzyme表现出类POD和类GPx酶活性，诱导显著的抗肿瘤效果。此外，Pt/Co BNzyme具有光热效应；在温和加热下，酶活性增加，导致肿瘤细胞死亡增加。酶活性与光热效应的结合显著抑制了细胞生长，并且细胞活力随着Pt/Co BNzyme浓度的增加而降低。通过活/死染色也获得了类似的结果。钙黄绿素-AM/碘化丙啶（PI）的荧光显示，由于酶活性（Pt/Co + H₂O₂组），近一半的肿瘤细胞被杀死。在NIR激光照射诱导的温和加热下，杀伤效果显著增强，导致几乎所有肿瘤细胞死亡（Pt/Co + H₂O₂ + L组）。值得注意的是，大多数细胞通过凋亡死亡。指示凋亡的Annexin-V染色显示几乎所有细胞死亡。温和的光热加热显著促进了酶活性，导致凋亡率超过82.7 ± 4.1%。一致地，caspase-3/7化学发光检测显示，酶活性在各治疗组中逐渐增加，Pt/Co + H₂O₂ + L诱导最显著的激活。caspase级联的强烈激活进一步证实细胞死亡主要由凋亡而非坏死介导。为了探索死亡机制，我们使用DCFH-DA和DTNB检测了细胞内ROS和GSH含量。由于类POD酶效应产生大量·OH，在Pt/Co + H₂O₂组中检测到更多绿色荧光。JC-1探针广泛用于检测线粒体损伤；在健康线粒体中，JC-1形成红色J-聚集体，而在受损线粒体中，它保持其绿色单体形式。值得注意的是，用Pt/Co + L和Pt/Co + H₂O₂处理导致红色荧光丢失和绿色荧光增加。重要的是，Pt/Co + H₂O₂ + L组中的绿色荧光显著升高，表明最严重的线粒体功能障碍，线粒体膜电位（ΔΨm）比Pt/Co + H₂O₂组降低了1.8倍。因此，这些ROS可引起钙离子水平和线粒体功能的变化，从而诱导凋亡。此外，类GPx酶效应导致细胞内GSH消耗，损害了肿瘤细胞的抗氧化能力，有助于·OH水平的增加。同样，温和的温度升高增强了这两种酶效应。

ICD被认为是免疫反应的关键起始因素。当ICD发生时，更多钙网蛋白（CRT）表达并易位至细胞膜外侧；同时，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和三磷酸腺苷（ATP）从细胞中释放。为了验证Pt/Co BNzyme治疗诱导的肿瘤死亡类型，对经受不同处理的Hepa1-6细胞进行了免疫荧光。在Pt/Co + H₂O₂ + L组中明显存在更多CRT。由于HMGB1的释放，在联合组中检测到较少的荧光。随后收集肿瘤细胞培养上清液并通过ELISA测试。与荧光结果一致，Pt/Co + H₂O₂ + L组上清液中HMGB1含量显著升高。此外，上清液中ATP含量也增加。令人鼓舞的是，我们发现Pt/Co+H₂O₂+L组中的HMGB1、CRT和APT水平与奥沙利铂（OXA）处理的阳性对照组几乎相当。这些结果表明Pt/Co BNzyme诱导了ICD，并且温和的温度升高增强了这一现象。如图所示，增加的DAMPs可以被DCs识别，促使DCs成熟并释放细胞因子，如IL-12和肿瘤坏死因子α（TNF-α）。为了在体外验证这一机制，建立了Transwell小室模型，其中肿瘤细胞加入上室，DCs加入下室。肿瘤细胞经受不同的预处理，然后使用Transwell系统与DCs共培养48小时，无直接细胞接触。然后，消化DCs并通过流式细胞术进行分析。成熟DCs的特征是细胞膜上表达CD80⁺CD86⁺。与PBS组相比，Pt/Co + H₂O₂ + L组中成熟DCs的百分比增加了超过39.8 ± 1.1%。同时，通过ELISA检测上清液中的细胞因子含量。成熟DCs分泌的IL-12和TNF-α水平在Pt/Co + H₂O₂ + L组均显著增加。这些结果表明，酶活性和光热效应的结合诱导了ICD和DC成熟，这鼓励我们进行后续的体内实验。

2.4 Pt/Co BNzyme的体内抗肿瘤效果

在将BNzyme应用于小鼠之前，我们首先进行了生物安全性测试。将不同浓度的Pt/Co BNzyme与从C57BL/6小鼠血液中提取的相同量的红细胞悬液混合。如图所示，所有红细胞在ddH₂O中溶胀，而在BNzyme溶液中少于5%的血细胞被破坏，表明良好的血液相容性。然后，通过尾静脉向健康C57BL/6小鼠注射5 mg kg^?1 Pt/Co以观察体内安全性。与注射PBS的小鼠相比，注射BNzyme的小鼠的主要生化和血细胞指标没有显著差异，表明Pt/Co不影响体内稳态。

由于EPR效应，纳米酶更易穿透肿瘤组织并长期保留。我们用ICG标记BNzyme用于实时监测体内肿瘤积累。由于介孔的受限堆积、与Co离子的配位以及在NIR照射下形成J-聚集体，有效防止了ICG泄漏。由于ICG在水溶液中的光漂白，随后使用荧光生物成像系统测量了ICG和ICG标记的Pt/Co在水中的光稳定性。游离ICG在连续照射25分钟后失去了约93.2%的初始荧光强度。相反，ICG标记的Pt/Co在连续照射结束时保留了几乎约92.1%的初始信号强度，表明介孔纳米酶可进一步用作ICG递送的纳米载体。因此，通过尾静脉注射后，ICG标记的Pt/Co BNzyme在C57BL/6小鼠的Hepa1-6肿瘤中显示出富集，荧光比其他区域更亮。在24小时，肿瘤显示出最大的荧光强度，表明此时BNzyme富集最多。然后，收集处理小鼠的主要器官以观察BNzyme的生物分布。纳米材料在体内注射时非常容易被网状内皮系统捕获。因此，我们在肝脏中检测到Pt/Co的存在；然而，在肿瘤组织中观察到更高的纳米酶和荧光水平。此外，为了进一步验证Pt/Co的肿瘤靶向能力，通过电感耦合等离子体光学发射光谱法（ICP-OES）评估了肿瘤和重要器官中的Pt含量。注射后24小时，在肿瘤组织中发现最高的Pt含量，这与荧光成像结果一致。而且，器官中的Pt水平在注射后随时间迅速下降；到第7天，仅残留痕量，进一步证明了优异的生物安全性。值得注意的是，通过测量Pt/Co的药代动力学，我们确定其血液循环半衰期为7.84小时，这比类似尺寸的Au纳米晶体的半衰期长得多，这主要归因于介孔纳米结构。

接下来，研究了Pt/Co BNzyme的体内抗肿瘤效果。当肿瘤体积达到80–100 mm³时，将小鼠分为四组：PBS、PBS +L、Pt/Co和Pt/Co + L组。根据上述富集结果，我们在注射后24小时进行光热治疗。在808 nm激光照射（0.6 W cm^?2, 10分钟）下，Pt/Co + L组中的肿瘤温度在4分钟内升高至42.7°C，最终温度达到44.8°C，而PBS + L组中的温度未超过38°C，表明Pt/Co + L具有一定的热效应。温和的温度升高由光热效应诱导，可以促进酶和免疫活性，从而协同增强肿瘤细胞杀伤。在治疗期间，每2天测量小鼠的肿瘤体积和体重。PBS和PBS+L组的肿瘤体积相似。由于TME中高水平的GSH和H₂O₂，Pt/Co BNzyme的类POD和类GPx酶活性有效抑制了肿瘤生长，与对照组相比。在温和温度升高的辅助下，Pt/Co + L组中的酶活性显著高于Pt/Co组。在观察期结束时，收集所有肿瘤进行进一步研究。Pt/Co + L组中的肿瘤尺寸和重量低于其他组。为了研究类GPx酶活性，测量了肿瘤组织中GSH的相对水平。由于协同的光热效应和酶活性，与对照组相比，Pt/Co + L组中的GSH水平降低了72%以上。接下来，制备肿瘤组织切片并用苏木精和伊红（H&E）、Ki67抗体和TUNEL试剂染色以观察分子变化。如图所示，肿瘤细胞增殖受到抑制，并且在Pt/Co + L组中存在许多死亡和凋亡的肿瘤细胞。这些结果证明了Pt/Co BNzyme良好的抗肿瘤效果。此外，收集实验小鼠的主要器官进行病理检查。与对照相比，Pt/Co BNzyme未引起主要器官明显的结构损伤或变化，支持其生物安全性。

2.5 Pt/Co BNzyme联合αPD-L1可诱导ICD以改善免疫反应并缓解免疫抑制状态

为了进一步研究Pt/Co BNzyme的免疫调节作用，我们在C57BL/6小鼠中构建了双侧肿瘤模型。将不同浓度的Hepa1-6肿瘤细胞接种到每只小鼠的两侧臀部：注射更多细胞一侧形成的肿瘤称为原发肿瘤，另一侧称为远隔肿瘤。随后将小鼠分为四组接受不同治疗：PBS、Pt/Co + L、αPD-L1和Pt/Co + L + αPD-L1。将50 μL的1 mg mL^?1 Pt/Co BNzyme直接注射到原发肿瘤中，随后在12小时后照射（808 nm, 0.6 W cm^?2, 10分钟）。在第0、3和6天通过腹腔注射给予100 μg αPD-L1抗体。然后在第10天处死4只小鼠进行免疫分析，并监测6只小鼠60天的存活情况。如图所示，未经治疗，原发和远隔肿瘤快速生长，所有六只小鼠在第32天死亡。免疫检查点抑制剂（ICIs）是最重要的肿瘤疗法之一，但免疫抑制的肿瘤微环境限制了其有效性。单独使用αPD-L1延迟了肿瘤生长，但所有这些小鼠在第44天死亡。由于其协同效应，Pt/Co BNzyme可以直接杀死原发肿瘤，效果优于ICI。此外，远隔肿瘤受到抑制，这可能是由于免疫反应的激活，Pt/Co + L组中最长存活时间达到52天。与ICI联合使用，Pt/Co + L + αPD-L1组中肿瘤的生长被有效减少。与其他组相比，联合组中原发和远隔肿瘤在第20天显著更小。联合治疗组的中位死亡率在60天时未达到，表明更好的存活率。此外，治疗期间未观察到体重的显著变化。

为了探索这一现象的机制，治疗后收集原发肿瘤进行分析。如图所示，在Pt/Co + L + αPD-L1组中，细胞膜上表达了更多CRT（绿色）。随着HMGB1（红色）的细胞外释放增加，细胞内HMBG1含量减少。类似地，组织匀浆中的ATP含量也显著降低。此外，与单独使用αPD-L1相比，Pt/Co + L更有效地诱导了ICD。在此过程中，DAMPs被DCs识别，刺激DC成熟。这些DCs随后通过淋巴管到达引流淋巴结（DLNs）。因此，我们从DLNs中分离DCs并通过流式细胞术进行分析。Pt/Co + L组中成熟DCs的比例超过34.5%，高于对照组。在联合使用αPD-L1的情况下，成熟率增加到39.9%，并且抗原呈递过程被有效启动。随后，DAMPs由成熟DCs在脾脏中呈递给T细胞。与先前结果一致，Pt/Co+L+αPD-L1组中CD3⁺CD8⁺ T细胞（细胞毒性T淋巴细胞，CTLs）的百分比几乎比Pt/Co + L组高11.5%。这些结果表明Pt/Co BNzyme可以在原发肿瘤中诱导ICD，促进抗原呈递细胞的激活，激活抗原特异性T细胞，并增强小鼠的免疫反应。

接下来，研究了远隔肿瘤的免疫环境。由于小鼠免疫系统的激活，更多CTLs被招募到远隔肿瘤，这通过流式细胞术验证。免疫荧光也显示Pt/Co+L+αPD-L1组中CD4⁺/CD8⁺ T细胞浸润更多，这在消除肿瘤中起重要作用。然而，由于TME和免疫逃逸，肿瘤中的免疫抑制细胞抑制和耗竭免疫细胞。髓源性抑制细胞（MDSCs）可以被肿瘤细胞死亡激活并显著抑制免疫细胞反应。ICI的联合使用可以影响这种抑制并增强免疫治疗功效。流式细胞术结果显示，Pt/Co+L+αPD-L1组中CD11b⁺Ly6G⁺ MDSCs的百分比降低了近20.2%。叉头框蛋白P3（Foxp3）是调节性T细胞（Tregs）的特异性标志物，与肿瘤的局部免疫耐受和免疫逃逸密切相关。免疫荧光染色也显示，Pt/Co+L+αPD-L1组远隔肿瘤中Foxp3⁺ Tregs（绿色）的数量减少。TME中的免疫调节细胞因子可以招募免疫抑制细胞并支持肿瘤发展；同时，这些免疫抑制细胞进一步增加细胞因子水平。IL-10和TGF-β1主要负责免疫