靶向TRIM16-OPTN轴：Sanggenol L通过抑制线粒体自噬和诱导凋亡增强胶质母细胞瘤对替莫唑胺的敏感性

本文揭示了桑根酮L（SL）通过调控TRIM16-OPTN轴增强胶质母细胞瘤（GBM）对替莫唑胺（TMZ）敏感性的新机制。研究发现SL作为新型自噬抑制剂，可促进E3泛素连接酶TRIM16介导的OPTN蛋白降解，阻断保护性自噬流并诱导细胞凋亡。利用脂质体递送系统，SL显著提高了TMZ在耐药株及动物模型中的疗效，为克服GBM化疗耐药提供了新策略。

　　

引言

胶质母细胞瘤（GBM）作为最具侵袭性的中枢神经系统肿瘤，标准治疗方案包括手术切除、放疗和替莫唑胺（TMZ）化疗。然而TMZ耐药性问题日益突出，其中自噬被证实是介导耐药的关键机制之一。桑树活性成分桑根酮L（Sanggenol L, SL）作为一种具有抗肿瘤活性的黄酮类化合物，其在GBM中的生物学作用和机制尚不明确。

桑根酮L促进自噬体形成并阻断自噬流同时诱导胶质母细胞瘤细胞凋亡

通过临床样本分析发现，自噬标志物LC3B和ATG5的表达随胶质瘤级别升高而增加，而凋亡标志物cleaved caspase-3（C-Caspase3）表达降低。从936种桑树代谢物中筛选出54种具有抗肿瘤活性的单体化合物，其中SL在正常胶质细胞SVGP12和GBM细胞LN-229中表现出显著差异的IC₅₀值。LC3B双标实验证实SL能够明显抑制GBM细胞的自噬流。

MTT实验表明SL以剂量依赖方式显著抑制GBM-3、LN-229和T98G细胞系的增殖，且对正常胶质细胞毒性较低。集落形成实验显示SL处理组的细胞克隆形成能力明显减弱。定量蛋白质组学富集分析提示SL处理后自噬和凋亡相关通路发生显著变化。

流式细胞术检测发现SL处理后凋亡细胞群显著增加，TUNEL染色进一步证实SL诱导的凋亡现象。Western blot分析显示凋亡相关蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3表达上调，BCL-2蛋白水平下降。线粒体与细胞质分离实验表明随着SL浓度增加，线粒体中细胞色素C水平显著降低，而细胞质中细胞色素C水平升高，提示存在线粒体损伤后的凋亡因子流出。

LC3B免疫荧光结果显示SL处理后胶质母细胞瘤细胞中自噬体显著富集。LC3B双标腺病毒实验证实SL诱导的自噬体积累导致自噬流阻断。Western blot结果进一步验证了自噬标志物LC3-II和促自噬效应因子ATG5在SL处理后呈剂量依赖性增加。p62的同步积累表明自噬过程无法完成， likely due to impaired fusion between autophagosomes and lysosomes or defective lysosomal degradation function，最终导致自噬流阻断。

巴弗洛霉素A1干预实验表明SL可能通过抑制自噬流来提高LC3-II水平。这些结果共同证明SL并非简单"激活自噬"，而是特异性促进自噬体形成的同时阻断晚期自噬流，这种自噬完整性的破坏阻止细胞通过自噬有效清除受损细胞器和蛋白质聚集体，导致细胞应激增加并最终诱导凋亡。

桑根酮L通过泛素化降解自噬受体OPTN导致线粒体自噬阻断

SL处理导致胶质母细胞瘤细胞内活性氧（ROS）水平显著升高，同时细胞内钙离子浓度显著增加，线粒体膜电位降低，这些变化与SL浓度增加和暴露时间延长呈正相关。

透射电镜（TEM）图像和线粒体与溶酶体免疫荧光共定位显示，虽然SL诱导胶质母细胞瘤细胞中自噬体积累，但线粒体未能与自溶酶体融合。基因富集分析显示SL处理后与自噬显著相关。定量蛋白质组学分析揭示线粒体自噬受体OPTN显著下调。

Western blot分析证实SL以时间和浓度依赖方式降低GBM-3、LN-229和T98G细胞系中OPTN蛋白水平。免疫荧光成像显示SL处理后胶质母细胞瘤细胞中OPTN明显降解。RT-PCR实验表明SL不影响OPTN的mRNA表达水平。

环己酰亚胺（CHX）实验表明SL可能调控OPTN蛋白的翻译后稳定性。泛素化水平检测显示SL处理显著增加OPTN的泛素化修饰。

桑根酮L通过抑制OPTN表达导致自噬阻断和GBM细胞凋亡

建立稳定过表达OPTN的细胞系后，细胞内钙测量和线粒体膜电位实验表明OPTN过表达显著减轻SL诱导的线粒体损伤。流式细胞术分析显示OPTN过表达显著减少SL诱导的胶质母细胞瘤细胞凋亡。

Western blot分析证实OPTN过表达降低SL处理的GBM细胞中OPTN、LC3BII/I、cleaved Caspase-9和cleaved Caspase-3的蛋白水平。线粒体细胞质分离实验进一步证实OPTN过表达显著抑制SL触发的关键线粒体凋亡因子细胞色素C的释放。

桑根酮L通过TRIM16降低OPTN蛋白稳定性

通过Co-IP联合质谱分析和SL处理后的定量蛋白质组学分析，筛选出前10个候选OPTN相互作用蛋白，其中TRIM16和MID1作为已知的E3泛素连接酶尤为突出。定量蛋白质组学热图数据显示SL处理后TRIM16显著上调。

Co-IP实验证实TRIM16与OPTN的相互作用强于MID1。SL浓度增加时，TRIM16表达呈剂量依赖方式增加，而MID1表达无变化。免疫组化分析显示GBM样本中TRIM16与OPTN表达呈负相关。

通过Co-IP、双分子荧光互补（BIFC）、Duo-link邻近连接 assay（PLA）和免疫荧光共定位等多种分析方法，一致证实TRIM16与OPTN在胶质母细胞瘤细胞中存在相互作用。结构域分析表明TRIM16的B-BOX结构域与OPTN的411-577氨基酸功能域相互作用。

泛素化实验显示TRIM16过表达显著增强OPTN泛素化。体外泛素化实验进一步证实TRIM16作为靶向OPTN的E3泛素连接酶。缺失TRIM16结合结构域显著减弱OPTN泛素化增强效应。利用野生型和突变型泛素质粒的泛素化实验表明，在缺乏K48的情况下TRIM16无法增加OPTN泛素化，提示TRIM16介导OPTN的K48连接的多泛素化。

通过PhosphoSitePlus、UbiBrowser和UbPred数据库计算预测OPTN上潜在的泛素化位点，鉴定出三个候选赖氨酸残基（448、489和501位）。泛素化实验表明489和501位点的突变显著降低TRIM16介导的OPTN的K48连接泛素化， triple突变体中泛素化水平下降最为明显，表明489和501位赖氨酸残基是TRIM16介导OPTN泛素化的关键位点。

CHX追踪实验表明TRIM16通过加速OPTN转换促进其降解，提示翻译后调控机制。

桑根酮L通过TRIM16-OPTN轴诱导自噬阻断进而诱导凋亡

构建TRIM16敲减的GBM细胞并筛选出最有效的shRNA#2进行后续实验。钙成像和线粒体膜电位实验显示TRIM16敲减显著减轻SL诱导的GBM细胞线粒体损伤。TUNEL染色实验进一步证实TRIM16敲减抑制SL诱导的凋亡，这归因于线粒体损伤减少。

Western blot分析显示SL处理的TRIM16敲减GBM细胞中OPTN、LC3B-II/I、cleaved Caspase-9和cleaved Caspase-3水平明显降低。线粒体细胞质分离Western blotting表明TRIM16敲减显著抑制SL诱导的关键线粒体凋亡因子细胞色素C的释放。

通过qPCR检测发现SL处理后LN-229、T98G和GBM-3细胞中TRIM16基因mRNA表达水平呈剂量依赖性上调。结合转录组学和TF-Target Finder工具筛选出TRIM16的六个潜在转录因子。

桑根酮L通过阻断TMZ耐药株的保护性自噬提高TMZ化疗敏感性

TMZ作为广泛用于GBM治疗的一线药物，由于反应性差和耐药性发展而临床疗效有限。本研究探索了TMZ与SL的协同潜力，使用Jin公式和q值≥1.15确认了长期协同作用。MTT实验结果表明TMZ与SL联合处理显著增强对细胞增殖的抑制。

LC3B双标实验显示TMZ耐药株中自噬流明显，而SL处理显著阻断自噬流。Western blot（WB）分析进一步证实SL抑制TMZ耐药细胞中的自噬流。流式细胞术和WB结果也表明SL显著增强TMZ耐药株的凋亡。

为评估TMZ和SL联合治疗的体内疗效，进行原位胶质母细胞瘤移植实验，发现接受联合治疗的小鼠肿瘤体积显著小于单药治疗组。基于SL的理化特性，本研究选择乙醇注入法制备纳米颗粒，使用大豆磷脂酰胆碱、胆固醇、DSPE-PEG2k-Biotin和DSPE-PEG2k-HA包裹SL，SL装载于双层中，DSPE-PEG2k-Biotin和DSPE-PEG2k-HA嵌入脂质体载体表面形成功能化脂质纳米颗粒。加入近红外染料IR-780便于药物追踪。透明质酸（HA）和生物素可特异性结合血脑屏障内皮细胞和胶质母细胞瘤细胞表面高表达的CD44受体和生物素受体，实现血脑屏障的靶向穿透和胶质母细胞瘤的靶向给药。

通过颈动脉灌注、尾静脉注射和腹腔注射评估C57小鼠中的药物分布，活体成像和生物素浓度测量显示尾静脉注射提供最一致的脑药物滞留和浓度。重要的是，连续静脉注射SL未引起主要器官的显著组织病理学改变。

建立小鼠原位肿瘤（LN-229-荧光素酶细胞）模型后，用TMZ、SL或其组合处理，活体成像显示SL在病变部位大量积累，联合治疗组肿瘤生长显著减少于单药治疗。免疫荧光实验证实脂质体SL在肿瘤部位优先积累，在炎症和肿瘤模型中的定位显著高于邻近组织。TMZ和SL联合治疗显著延长治疗小鼠的生存期，H&E染色显示肿瘤体积显著减小。

为进一步验证SL联合TMZ的治疗效果，在裸鼠中建立人源胶质瘤异种移植模型，联合治疗也显示出显著优势。免疫组化分析验证联合治疗后肿瘤切片中的蛋白表达模式与体外观察一致。

讨论

本研究通过44例临床胶质瘤样本分析发现LC3B和ATG5表达随肿瘤级别增加而升高，cleaved caspase-3降低，支持保护性自噬在GBM进展和治疗失败中起关键作用。

通过化合物筛选鉴定出来自桑树皮的天然黄酮类化合物桑根酮L作为胶质母细胞瘤细胞增殖的选择性抑制剂。SL不仅通过LC3B双标证实阻断自噬流，还通过TUNEL染色和caspase激活诱导显著凋亡，表明SL破坏TMZ耐药GBM细胞中自噬赋予的生存优势。

机制研究揭示SL靶向TRIM16–OPTN轴，这是胶质瘤生物学中的新型调控通路。SL处理导致OPTN的泛素化介导降解，OPTN是自噬体-溶酶体融合的关键受体。鉴定TRIM16作为负责此效应的E3连接酶，其干扰逆转SL诱导的OPTN降解和自噬阻滞，证明该轴对SL介导的细胞毒性至关重要。

重要的是，SL与TMZ协同克服GBM-3和T98G细胞的耐药性，这种组合效应归因于增强的自噬抑制和增加的凋亡。为支持其转化潜力，开发使用乙醇注入法的药物递送制剂，改善SL的溶解性和脑穿透性。在原位小鼠模型中，SL与TMZ联合显著延迟肿瘤生长并增强治疗效果。

本研究首次鉴定TRIM16作为胶质瘤中OPTN的上游调节因子，并证明靶向该通路可逆转TMZ耐药。与巴弗洛霉素A1等其他自噬抑制剂相比，SL表现出明显优势：巴弗洛霉素A1广泛作用于溶酶体功能，由于破坏正常细胞中必需的溶酶体过程可能导致脱靶效应和系统毒性；而SL特异性靶向TRIM16-OPTN轴，该通路更选择性参与GBM细胞自噬流调控， potentially reducing adverse effects on normal tissues。此外，巴弗洛霉素A1主要抑制晚期自噬，而SL不仅阻断自噬流还同时诱导凋亡，这种双重机制在克服TMZ耐药方面可能比单一作用模式的自噬抑制剂提供更优效力。这种特异性和多靶点活性使SL成为GBM治疗临床转化的更有前景候选物。

实验方法

实验使用LEMEITIAN MEDICINE的桑根酮L（DS0100）和MedChemExpress的替莫唑胺（Cat#HY-17364）。抗体采购自Proteintech和Cell Signaling Technology。细胞系包括LN-229、T98G、SVGP12和HEK293FT，患者来源的GBM-3细胞系由大坪医院提供。TMZ耐药株采用浓度递增法构建。

通过MTT实验评估细胞活力，EDU染色检测细胞增殖，流式细胞术分析细胞周期和凋亡，TUNEL染色检测凋亡。使用shRNA敲减TRIM16，质粒转染使用Lipofectamine 2000。Western blot、label-free定量蛋白质组学、泛素化实验、qPCR、免疫荧光、集落形成实验、H&E染色等按标准方案进行。

动物实验使用4周龄雌性BALB/c-Nude小鼠，颅内注射LN-229-Luciference细胞，尾静脉注射SL或TMZ处理。人源胶质瘤异种移植模型（PDX）通过皮下注射肿瘤单细胞悬液构建。

功能实验包括GST-pulldown、BIFC、Duo-Link PLA、线粒体膜电位检测、钙离子荧光探针检测、ROS检测、体外蛋白泛素化实验等。采用Jin公式评估药物联合效应，体内成像使用IVIS SpectrumCT系统。

功能化脂质体采用乙醇注入法制备，使用大豆磷脂酰胆碱、胆固醇、DSPE-PEG2k-Biotin、DSPE-PEG2k-HA和IR-780包裹SL。通过Zeta电位和动态光散射分析表征脂质体特性，透析法评估药物释放 profile，LC-MS进行药代动力学分析。

数据以Mean ± SD表示，使用GraphPad Prism 8进行统计学分析，Student's t检验评估显著性。