组蛋白乳酸化修饰通过上调VRK1表达促进胶质瘤干细胞干性与增殖的机制研究

本研究揭示了乳酸通过诱导组蛋白H3K18乳酸化（H3K18la）上调VRK1表达，进而通过VRK1/YBX1/SOX2通路调控胶质瘤干细胞（GSCs）干性与增殖的新机制。研究开发了靶向VRK1的纳米脂质体（A/TMZ-siVRK1），证实其可有效抑制GSCs功能，为胶质母细胞瘤（GBM）治疗提供了潜在治疗靶点和新型治疗策略。

　　

引言

胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见的恶性原发性脑肿瘤，其特征是治疗抵抗和高复发率。胶质瘤干细胞（GSCs）作为肿瘤细胞中的一个亚群，在治疗抵抗和复发中起关键作用。肿瘤细胞表现出独特的代谢模式，即使在氧气充足的条件下也不发生完全氧化，而是依赖糖酵解产生乳酸，这一现象被称为有氧糖酵解或Warburg效应。乳酸不仅是能量产生的代谢底物，还作为信号分子调节多种肿瘤相关生理过程。近年研究发现，乳酸可作为蛋白质赖氨酸残基翻译后修饰的底物，即赖氨酸乳酸化（Kla），直接调控蛋白质功能。组蛋白H3K18乳酸化（H3K18la）直接促进基因转录，参与巨噬细胞M1/M2极化、体细胞重编程和肿瘤发生。

乳酸促进GSCs的干性和增殖

研究利用四个GSC细胞系（GSC4、GSC21、GSC40和GSC63）探讨乳酸对GSC干性和增殖的调控作用。发现乳酸处理可普遍上调干性标志物（SOX2、SOX9、OLIG2、CD133、NES和POU3F2）的mRNA和蛋白水平。从功能角度看，乳酸增加了GSCs形成的神经球大小，增强了GSCs的自我更新能力，并增加了神经球形成数量。单羧酸转运蛋白1/2（MCT1/2）将外源性乳酸从肿瘤微环境转运入细胞调节细胞功能，而乳酸脱氢酶A（LDHA）使肿瘤细胞能够内源性产生乳酸。使用MCT1/2抑制剂AR-C155858和LDHA抑制剂（R）-GNE-140证实，外源性和内源性乳酸均能促进GSCs的干性和增殖。

乳酸通过VRK1调控GSCs的干性和增殖

通过生物信息学基因筛选，发现VRK1是乳酸介导GSC干性调控的关键分子。VRK1在GSCs中相比配对的分化型胶质瘤细胞（DGCs）显著过表达。建立稳定转染的VRK1敲低和过表达细胞系，证实VRK1促进GSCs的增殖和自我更新。体内实验显示，VRK1敲低抑制了颅内肿瘤生长，延长了裸鼠生存时间，降低了肿瘤形成潜力。VRK1与干性标志物SOX2相关性最强，调控SOX2在转录水平的表达。乳酸通过VRK1调控GSCs的干性和增殖，VRK1敲低后，乳酸无法增强GSCs的自我更新能力和神经球形成。

乳酸通过H3K18la调控GSCs中VRK1的表达

乳酸提高了GSCs中总体Kla水平，同时上调了VRK1和SOX2表达。VRK1本身不发生乳酸化修饰。乳酸促进GSCs中组蛋白乳酸化，特别是H3K18位点。CUT&Tag和ChIP实验证实H3K18la结合到VRK1启动子区域。乙酰转移酶p300抑制剂C646降低乳酸化水平并下调VRK1和SOX2表达，而组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂曲古抑菌素A（TSA）提高乳酸化水平并上调VRK1和SOX2表达。外源性和内源性乳酸均能促进组蛋白乳酸化，从而调控VRK1和SOX2的表达。

VRK1增强YBX1蛋白稳定性并促进其磷酸化

通过免疫共沉淀质谱分析鉴定出184个与VRK1特异性结合的蛋白质，其中YBX1与SOX2在GSCs中相关性最强。Co-IP证实VRK1直接与YBX1结合。VRK1调控YBX1蛋白水平但不影响其mRNA水平，VRK1增强YBX1蛋白稳定性，减少其通过蛋白酶体途径的降解。VRK1降低YBX1的K48连锁泛素化，从而稳定YBX1。VRK1直接与YBX1结合，且其激酶结构域对于维持VRK1与YBX1的相互作用至关重要。VRK1以剂量依赖性方式磷酸化YBX1，促进YBX1核转位。YBX1 Ser102磷酸化对其核转位至关重要，该位点突变（YBX1 S102A）无法增加SOX2表达。

VRK1/YBX1/SOX2通路调控GSCs的干性

YBX1结合到SOX2启动子区域，参与SOX2的转录调控。YBX1敲低抑制了VRK1过表达引起的SOX2表达上调、神经球增殖、自我更新和神经球形成的促进作用。缺氧和乳酸均促进GSCs和DGCs中VRK1/YBX1/SOX2通路的激活。VRK1敲低显著抑制了缺氧诱导的GSCs增殖和自我更新增强，并减弱了缺氧诱导的YBX1和SOX2上调。临床胶质瘤组织标本中，VRK1、YBX1和SOX2在GBM组织中表达显著升高，且随胶质瘤病理分级升高而增加，三者表达呈正相关。

A/TMZ-siVRK1的制备与表征

研究设计了基于siVRK1的纳米脂质体A/TMZ-siVRK1，以靶向VRK1并增强其与替莫唑胺（TMZ）的协同效应。纳米脂质体表现出良好的血清稳定性和pH敏感性释放特性。Angiopep-2修饰增强了纳米脂质体穿透血脑屏障（BBB）的能力和靶向胶质瘤细胞的特性。体内外实验表明A/TMZ-siVRK1能有效抑制GSCs增殖并诱导细胞凋亡。

A/TMZ-siVRK1的体内治疗效果

在颅内肿瘤异种移植模型中，A/TMZ-siVRK1显著抑制了肿瘤生长，延长了生存时间。免疫组化显示A/TMZ-siVRK1处理组中VRK1、YBX1和SOX2表达显著降低，Ki-67阳性细胞数最少。药代动力学研究表明A/TMZ-siVRK1能延长TMZ和siVRK1的血浆半衰期，提高在GBM组织中的药物浓度。生物相容性实验表明A/TMZ-siVRK1具有良好的体内生物安全性。

讨论与结论

本研究建立了肿瘤微环境中代谢物乳酸与GSCs干性调控之间的联系，揭示了乳酸通过组蛋白H3K18乳酸化上调VRK1表达，进而通过VRK1/YBX1/SOX2通路调控GSCs干性和增殖的新机制。开发的VRK1靶向纳米脂质体A/TMZ-siVRK1能有效抑制GSCs的干性和增殖，为GBM治疗提供了潜在治疗靶点和新型治疗策略。