玉米线粒体蛋白RTA9与S40互作通过调控活性氧稳态增强蚜虫抗性的机制研究

本研究揭示了玉米中线粒体定位的RTA9蛋白通过与衰老调控因子S40相互作用，负向调控其蛋白稳定性，从而调控蚜虫取食诱导的活性氧（ROS）稳态，显著增强玉米对蚜虫（Rhopalosiphum maidis）的抗性。该机制为培育抗蚜虫玉米新品种提供了重要靶点（RTA9/S40），且不影响谷物产量，具有重要应用价值。

　　

2.1 玉米突变体rta9-1对蚜虫易感

通过乙烷甲基磺酸盐（EMS）诱变的突变体库中筛选到一个蚜虫易感突变体rta9-1。与野生型B73相比，成熟rta9-1幼苗的叶鞘和叶片上定居的蚜虫数量约为野生型的10倍。在温室可控条件下重复蚜虫生物测定，接种21天后，rta9-1后代植株的叶鞘上仍定居大量蚜虫。此外，取食rta9-1后代植株的蚜虫分泌的蜜露量显著多于取食B73的蚜虫，接种一周后蚜虫存活率显著更高，且蚜虫体重也更大。因此，rta9-1是一个蚜虫易感突变体，更适宜蚜虫定殖。

2.2 利用MutMap方法克隆RTA9

将蚜虫易感突变体rta9-1与野生型B73回交获得rta9-1/RTA9 F₁种子，F₁植株表现出与B73相同的蚜虫抗性水平，表明rta9-1的蚜虫易感性表型可能由隐性突变引起。采用MutMap方法，从rta9-1/RTA9 F₁植株衍生的分离F₂群体中选取25株蚜虫易感幼苗，提取基因组DNA并混合建库进行基因组测序。SNP-index分析在3号染色体上发现一个主峰，包含384个紧密连锁的SNP。其中，位于外显子区的一个C-to-T替换（位置4498925）导致Gln（CAG）变为终止密码子（TAG），预测该突变会造成Zm00001d039444编码的蛋白翻译提前终止。通过衍生酶切扩增多态性序列（dCAPS）标记和Sanger测序验证，在具有突变表型的混合DNA池中，该C-to-T SNP为纯合型。为进一步验证Zm00001d039444是rta9-1蚜虫易感表型的因果基因，从ChinaMu数据库订购了一个Mu插入突变体rta9-2，该突变体表现出与EMS突变体rta9-1相似的蚜虫易感表型。因此，将Zm00001d039444命名为RTA9。

RTA9是单外显子基因，编码一个植物特有的未知功能域641（DUF641）蛋白，此前未报道与蚜虫抗性相关。在B73的不同组织中均检测到RTA9转录本，在雄穗中表达量相对较高，其次是雌穗，叶片中表达量最低。蚜虫侵染后不同时间点检测RTA9转录水平，发现其表达量先轻微上升，随后短暂下降，在侵染后24小时达到峰值。

2.3 RTA9过表达增强玉米蚜虫抗性且不影响谷物产量

在KN5585背景中构建过表达RTA9的转基因株系（RTA9-OE），并将绿色荧光蛋白（GFP）编码序列与RTA9框内融合克隆。通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）验证，RTA9-OE株系中RTA9转录水平显著上调。免疫印迹分析使用抗GFP抗体表明RTA9-GFP在这些转基因植株中积累。

评估RTA9过表达对蚜虫的影响，接种21天后，RTA9-OE株系上的蚜虫数量显著少于野生型幼苗。与此一致，RTA9-OE幼苗上蚜虫分泌的蜜露量远少于野生型。RTA9-OE植株上的蚜虫数量仅为野生型的约25%，且定居在RTA9-OE植株上的蚜虫平均体重低于野生型。许多情况下，增强植物防御的抗性基因会带来权衡效应。因此，检查了RTA9-OE株系和野生型KN5585的农艺和产量相关性状。RTA9-OE植株的株高和穗位高降低，但穗叶更长更宽。重要的是，在田间条件下，RTA9过表达不会负面影响种子生产，包括穗重、百粒重和单穗粒重等性状。综上所述，RTA9过表达提高了玉米的蚜虫抗性，且不影响谷物产量。

2.4 RTA9与S40发生物理相互作用

使用STRING在线工具分析RTA9的蛋白质-蛋白质相互作用网络，鉴定出衰老调控蛋白S40（由Zm00001d003009编码）是RTA9的潜在互作伙伴。为测试RTA9与S40的关系，通过将编码RTA9与GFP融合（RTA9-GFP）或S40与红色荧光蛋白mCherry融合（S40-mCherry）的构建体转染玉米原生质体，评估它们的亚细胞定位。RTA9-GFP在细胞中呈点状分布，与线粒体标记染料Mito Tracker Red重叠，表明RTA9定位于线粒体。相比之下，S40分布在整个细胞中，存在于细胞核和细胞质中。RTA9-GFP信号与S40-mCherry信号部分重叠，表明RTA9和S40在线粒体中部分共定位。

进行靶向酵母双杂交（Y2H） assay验证RTA9与S40的相互作用。携带pGADT7-S40和pGBKT7-RTA9的酵母细胞能够在缺乏Trp、Leu、His和Ade的合成确定（SD）选择培养基上生长，而包含所有其他质粒组合的细胞不能生长，表明这两种蛋白在酵母中能够相互作用。为确定这种相互作用是否也发生在植物细胞中，在本氏烟叶片中使用萤火虫荧光素酶（LUC）互补成像 assay。共浸润nLUC-RTA9（编码LUC N端半段与RTA9融合）和cLUC-S40（编码LUC C端半段与S40融合）的叶片表现出强烈的LUC活性，而其他构建体组合未显示任何LUC信号。双分子荧光互补（BiFC） assay证实，当它们的编码质粒共转染到玉米原生质体时，RTA9-cYFP（RTA9与YFP N端半段融合）与S40-nYFP（S40与YFP C端半段融合）相互作用。还使用携带RTA9-GFP和S40-FLAG转基因的F₁植株进行体内蛋白质共免疫沉淀（Co-IP） assay。使用抗GFP抗体免疫沉淀后，在沉淀的蛋白质中检测到S40-FLAG，证实RTA9-GFP在植物细胞中与S40-FLAG相互作用。最后，Pull-down assay证实RTA9和S40在体外直接相互作用，因为RTA9-MBP-His（RTA9与麦芽糖结合蛋白[MBP]融合）被S40-GST（S40与谷胱甘肽S-转移酶[GST]融合）下拉。这些结果表明，RTA9在体外和体内均能与S40发生物理相互作用。

2.5 S40敲除和过验证实其在玉米蚜虫抗性中的作用

S40是单外显子基因。RT-qPCR分析在多种玉米组织中检测到S40转录本，在根和雄穗中表达水平相对较高。蚜虫侵染后，S40表达量早期下降，在侵染后6小时达到峰值，随后逐渐降低，在24小时达到最低水平。为研究S40可能的抗蚜功能，在B104背景中使用成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关核酸酶9（Cas9）介导的基因编辑技术构建了S40敲除突变体。通过PCR和Sanger测序验证了一个纯合s40敲除突变体的身份。s40突变体在S40编码区有一个1-bp插入，导致开放阅读框移码。

蚜虫生物测定显示，S40功能缺失显著增强玉米对蚜虫的抗性；取食s40幼苗的蚜虫数量、蜜露分泌量、存活率和体重均显著低于取食野生型B104的蚜虫。与RTA9-OE株系类似，评估了s40突变体的农艺和产量相关性状。突变体植株在关键农艺性状上未表现出显著不利影响，包括植株结构（株高和穗位高）、叶片形态（穗叶长和宽）和种子生产（穗长、穗粗、穗重、百粒重和单穗粒重）。

在B104背景中构建由Ubiquitin启动子驱动过表达S40-FLAG的转基因株系（S40-OE），并通过PCR和RT-qPCR分别确认转基因的存在和表达。转基因植株的S40表达水平显著高于野生型，并且通过免疫印迹分析使用抗FLAG抗体表明S40-FLAG在这些植株中积累。S40-OE植株的蚜虫抗性低于野生型，因为接种后S40-OE株系上的蚜虫数量显著多于野生型。此外，取食S40-OE植株叶片的蚜虫分泌的蜜露量、存活率和体重均显著更高。这些结果证实S40作为玉米蚜虫抗性的负调控因子。

2.6 RTA9负向调控S40蛋白稳定性

为阐明RTA9-S40相互作用的影响，比较了在野生型B73和KN5585以及rta9-1和RTA9-OE植株制备的原生质体中S40-GFP的荧光强度。rta9-1突变体原生质体中S40-GFP荧光强度显著高于野生型B73。然而，在RTA9-OE原生质体中，其荧光强度显著低于对照KN5585，表明RTA9负向影响S40的积累。

为进一步测试RTA9是否影响S40稳定性，使用在大肠杆菌中重组纯化的S40-GST进行无细胞蛋白质降解 assay。将S40-GST添加到从野生型KN5585或RTA9-OE幼苗制备的蛋白质提取物中，并在不同时间点收集等分试样，使用抗His抗体通过免疫印迹分析。发现重组S40-GST在RTA9-OE株系的蛋白质提取物中的降解速度显著快于在KN5585中的降解速度。这些结果表明RTA9在体外和体内均负向调控S40蛋白的稳定性。

2.7 RTA9功能缺失导致ROS稳态失衡

为确定RTA9在蚜虫抗性中的作用机制，使用转录组深度测序（RNA-seq）分析研究了rta9-1和s40相对于各自野生型B73和B104的差异表达基因（DEG）。为研究RTA9在玉米响应蚜虫中的作用，在每个遗传背景内进行成对比较：蚜虫侵染与非侵染B73（Tr_B73 vs CK_B73），以及蚜虫侵染与非侵染rta9-1突变体（Tr_rta9 vs CK_rta9）。通过检查B73和rta9-1中鉴定的DEG的重叠，定义了基因型特异性DEG列表。因此，在B73和rta9-1中鉴定出281个共同DEG，另有3193个基因在B73中特异性表达，只有521个基因在rta9-1突变体中独特诱导。基因本体（GO） term富集分析显示，B73蚜虫侵染后超过200个DEG与氧化还原酶活性相关，而等效基因在rta9-1中未差异表达。这一发现表明蚜虫能够以RTA9依赖的方式诱导玉米中与氧化还原酶活性相关的基因表达发生变化。

此外，B104和s40之间有158个DEG共享，而759个DEG是蚜虫侵染B104特有的，另外959个DEG是蚜虫侵染s40特有的。GO term富集分析显示，与氧化还原酶活性相关的通路在蚜虫侵染后的野生型B104中排名第八（Q值，0.0014），而在抗蚜性更强的s40中升至第一（Q值，3.4328E-09），表明S40功能缺失改变了响应蚜虫的氧化还原酶活性相关基因的表达。蚜虫侵染B73和蚜虫侵染s40共享的DEG（在图6A中灰色虚线突出显示）在几个已报道的昆虫抗性通路中富集，包括萜类生物合成、细胞壁生物合成、JA/SA响应和氧化还原酶活性。这一结果表明RTA9和S40通过多种机制 contribute to玉米蚜虫抗性。

氧化还原酶活性通路在DEG中富集的观察促使我们研究rta9-1和s40以及各自野生型中的ROS积累。 accordingly，用ROS探针H₂DCFDA染色叶片，并量化其氧化产物的荧光强度。确定非侵染rta9-1植株积累的ROS水平显著高于野生型B73。然而，蚜虫侵染后，B73中的ROS水平显著上升，超过rta9-1中的水平。蚜虫侵染也诱导rta9-1中的ROS积累，水平高于非侵染植株，但程度低于B73，导致ROS积累显著低于蚜虫侵染的B73。这一结果也得到3,3′-二氨基联苯胺（DAB）和氮蓝四唑（NBT）染色的支持。这些发现表明蚜虫侵染改变了玉米细胞中的氧化平衡，这依赖于RTA9。相比之下，s40中的ROS含量表现出相反的模式，无论蚜虫侵染与否，s40中的ROS水平均显著高于B104。还检测了RTA9-OE和S40-OE植株以及各自野生型KN5585和B104中的ROS水平。基于荧光强度，RTA9-OE株系中的ROS含量显著高于野生型，而S40-OE细胞中的ROS水平显著低于野生型。这些结果表明RTA9-S40相互作用可能通过改变玉米中的ROS稳态来调控蚜虫抗性。

3 讨论

在植物与其昆虫害虫之间持续的进化军备竞赛中，植物进化出了多种防御策略，包括精确调控抗昆虫基因表达以保护 against侵染，从而增强其适应性和抗性能力。然而，大部分这些防御相关基因的分子机制仍知之甚少。本研究证明线粒体蛋白RTA9及其互作伙伴S40通过调控ROS稳态来增强玉米对蚜虫的抗性。

侵染期间，蚜虫首先用其口针探测植物表皮，然后穿透韧皮部，随后将唾液分泌到寄主的叶肉细胞中。这一行动，连同物理损伤和效应蛋白注射等刺激，触发各种类型ROS的产生。本研究的转录组分析显示，蚜虫取食后大量差异表达基因在与氧化还原酶活性相关的基因中富集，但在rta9-1中则不然。与此观察一致，蚜虫取食后B73和rta9-1植株叶片中的ROS水平相对于非侵染对照均升高，但在侵染的rta9-1中达到的水平显著低于侵染的野生型植株。RTA9-OE株系比其野生型KN5585积累更高的ROS水平，这与RTA9在蚜虫抗性中的正调控作用一致。先前研究表明植物中ROS（H₂O₂）的产生对蚜虫生长有负面影响；因此，rta9植株中较低的ROS水平可能解释为什么蚜虫更倾向于在这些植株上定殖而非野生型。此外，我们注意到与萜类生物合成、细胞壁生物合成、响应JA和响应SA相关的通路在蚜虫侵染后的DEG中富集。这一观察表明RTA9和S40可能以多种方式 contribute to玉米植株对蚜虫的抗性。

线粒体是半自主细胞器，具有各种电子传递链（ETC），是细胞中ROS的主要来源。线粒体定位蛋白的变化往往会改变细胞内ROS的平衡，进而影响植物抗性。例如，线粒体蛋白RTP7通过影响线粒体呼吸链复合物I的亚基来调节ROS水平，而RTP7功能缺失则增强植物对多种植物病原体和盐胁迫的抗性。类似地，水稻中缺乏线粒体定位蛋白NATURAL BLIGHT LEAF 3的突变体积累H₂O₂，并表现出对生物和非生物胁迫的增强抗性。考虑到RTA9的亚细胞定位，我们推测它可能参与线粒体功能，如呼吸链。RTA9功能缺失可能 disrupts线粒体电子传递，导致rta9-1突变体中基线ROS水平高于野生型。因此，rta9突变体以组成型更高的基线水平积累ROS than野生型。然而， upon蚜虫侵染，rta9-1突变体表现出比野生型对照更 modest的ROS水平增加。相反，RTA9-OE株系显示ROS水平升高和蚜虫抗性增强。这些结果表明线粒体蛋白RTA9是蚜虫侵染期间ROS积累所必需的。因此，rta9突变体中受损的RTA9介导的ROS积累限制了氧化爆发，最终导致对蚜虫的易感性增加。

蛋白质亚细胞定位、LUC互补成像 assay、BiFC assay、Co-IP assay和Pull-down分析均表明RTA9和S40部分共定位并在体外和体内发生物理相互作用。此外，RTA9负向调控S40的稳定性，这解释了这些蛋白以相反方式影响蚜虫抗性的原因。例如，rta9突变体比野生型B73更易感蚜虫侵染，而s40突变体则比其野生型B104更具抗性。S40是大麦（Hordeum vulgare）中DUF584家族成员HvS40的同源物，最初被报道与叶片衰老相关。HvS40表达在各种衰老条件下上调，从暗诱导衰老到大麦叶片中年龄依赖性衰老，使其成为衰老的有用标记基因。据我们所知，DUF584尚未被报道与植物中的昆虫抗性相关。本研究报道S40的过表达或敲除会导致ROS水平的变化，这与蚜虫抗性的变化相关。先前研究表明细胞质信号通过逆行信号调控核基因表达。RTA9定位于线粒体并调节S40稳定性，而S40均匀分布在植物细胞内，包括线粒体和细胞核，其功能缺失改变了ROS稳态。因此，RTA9-S40模块的调控也可能通过逆行信号实现，这种可能性值得进一步研究。RTA9影响S40稳定性的机制也应进一步探索。

基于以上结果，我们提出RTA9介导玉米中蚜虫触发的信号，响应蚜虫的物理损伤或唾液蛋白，从而激活依赖于ROS爆发的信号通路。总之，线粒体定位的RTA9-S40蛋白复合物通过调节植物的氧化还原状态参与调控玉米的蚜虫抗性。RTA9过表达和S40敲除 confer蚜虫抗性，且不降低田间玉米种子产量，表明RTA9和S40是培育抗蚜虫玉米品种的潜在候选基因。