年轻再生障碍性贫血患者中基础与详细端粒流式FISH检测的诊断性能比较：一项揭示端粒生物学疾病筛查策略的真实世界研究

本文深入探讨了基础（淋巴细胞与粒细胞）与详细（增加四个淋巴细胞亚群）端粒长度（TL）流式FISH检测在年轻再生障碍性贫血（AA）患者中筛查端粒生物学疾病（TBD）的诊断性能。研究通过对439例患者的回顾性分析，揭示了详细检测在轻度AA（mAA）中具有更高的特异性与阳性预测值（PPV），为TBD的精准识别与避免误诊提供了关键依据，并强调了在多数病例中仍需基因检测等额外诊断手段以确认TBD。

　　

引言

再生障碍性贫血（AA）是一种以造血干细胞和祖细胞（HSPC）丢失导致骨髓细胞减少和血细胞减少为特征的骨髓衰竭（BMF）性疾病。其严重程度分为中度、重度和极重度，具有重要的诊断、治疗和预后意义。AA多由免疫介导的HSPC破坏引起，但也可能源于先天性BMF综合征，其中端粒生物学疾病（TBDs）是重要的一类，在部分队列中超过70%的患者出现BMF，尤其在早发患者中更为常见。确定AA是否继发于TBD对指导治疗至关重要，例如，免疫抑制治疗（IST）通常对免疫介导的重度AA（SAA）有效，但对TBD相关AA无效。造血干细胞移植（HSCT）策略也显著不同：TBD患者需筛查相关供体是否患有相同疾病，需要调整预处理方案以应对其对烷化剂和辐射的高度敏感性，并需长期监测TBD相关疾病如肺纤维化、肝病和头颈部鳞状细胞癌。

TBD的诊断可通过识别至少19个基因中的胚系致病或可能致病（P/LP）变异来支持，但意义未明变异（VUS）常见，且许多临床诊断为TBD的患者缺乏明确的遗传学病因，这可能反映了对TBD相关基因认知的不足。通过流式细胞术结合荧光原位杂交（Flow-FISH）测量端粒长度（TL）已成为一种有价值的诊断工具，可独立使用或与基因检测结合使用。端粒是染色体末端的保护性核蛋白结构，长度以千碱基计。在健康人群中，端粒在大多数体细胞中随细胞分裂逐渐缩短，导致年龄依赖性TL下降。在TBDs中，大多数受影响个体的TL异常短于年龄预期。极度缩短的端粒会触发过早衰老和干细胞耗竭，驱动疾病发生。

目前有两种临床Flow-FISH检测方法：基础检测（评估总淋巴细胞和粒细胞TL）和详细检测（还包括四个淋巴细胞亚群：初始T细胞、记忆T细胞、B细胞和NK细胞）。Alter等人在其开创性研究后的扩展队列中对65例确诊TBD患者和127名未患病亲属进行了详细检测。淋巴细胞TL极低（VL；<1st百分位数）对TBD诊断的敏感性为97%，特异性为91%，阳性预测值（PPV）为85%，阴性预测值（NPV）为98%。在三个或四个（≥3）淋巴细胞亚群中TL极低表现出最佳整体诊断性能（敏感性98%，特异性94%，PPV 89%，NPV 99%），而单独粒细胞TL的特异性和PPV最低（分别为82%和73%）。然而，Flow-FISH在表现为AA的患者（无论是否有潜在TBD）中的诊断效用尚未在真实世界环境中进行评估。这至关重要，因为AA中的复制压力可能加速端粒缩短，而与胚系缺陷无关。

材料与方法

本研究（详细端粒长度检测在Flow-FISH中的效用）经贝勒医学院机构审查委员会批准，并豁免知情同意。通过电子病历查询，回顾性分析了2008年至2022年在德克萨斯儿童医院接受Flow-FISH TL检测的患者。仅接受基础检测的受试者仅用于测试年份分析。对其余队列，通过查阅临床文档确定TL检测的适应证。仅因亲属TL异常而检测的个体被记录但排除在进一步分析之外。提取了人口统计学、临床和实验室数据。Flow-FISH结果分为极低（VL）、低（L）、正常（N）、高（H）或极高（VH）（分别对应<1st、≥1st–<10th、≥10th–<90th、≥90th–<99th和≥99th百分位数）。记录最接近TL检测日期的绝对中性粒细胞计数（ANC）、淋巴细胞、血小板和网织红细胞计数以及血红蛋白。使用输血前值。

AA严重程度分类如下：SAA定义为骨髓细胞度<25%且至少出现两种血细胞减少：ANC <0.5 x 10⁹/L、血小板计数<20 x 10⁹/L或血红蛋白<8 g/dL，并包括极重度SAA（ANC <0.2 x 10⁹/L）。中度AA（MAA）定义为年龄相关的骨髓增生低下和至少两种血细胞减少（ANC <1.2 x 10⁹/L、血小板计数<70 x 10⁹/L或血红蛋白<8.5 g/dL）但未达到SAA标准。轻度AA（mAA）定义为年龄相关的骨髓增生低下伴至少一种年龄调整后的外周血细胞减少，但未满足MAA或SAA标准。尽管MAA定义不一且常与mAA合并为非SAA，但选择这些定义是为了区分需要更多与更少紧急调查的病例。

分类变量以频率和比例汇总，连续变量以中位数和四分位距报告。使用卡方检验或Fisher精确检验比较分类变量，使用Kruskal-Wallis检验比较连续变量。为评估Flow-FISH的诊断性能，使用TBD与非TBD的复合分类，以及TL在淋巴细胞、≥3淋巴细胞亚群及淋巴细胞和粒细胞中分类为<或≥1st百分位数（vl或l、n、h或vh）。使用标准方程计算这些tl预测tbd诊断的敏感性、特异性、ppv和npv。使用cohen's>

结果

血液疾病是四级儿科医院TL检测的主要适应证

为评估基础（2 panel）与详细（6 panel）Flow-FISH作为不同严重程度AA患者TBDs筛查工具的性能，识别了2008年至2022年间在德克萨斯儿童医院接受TL检测的所有患者（n=533）。超过一半的检测在2017年至2022年间进行。2009年后，详细检测的使用增加，最终占所有检测的92%（n=491）。为后续分析，排除了仅接受基础检测的患者（n=42），以在同一队列中直接比较检测性能。

通过电子病历审查确定检测适应证。仅因亲属TL异常（n=50）或随访检测（n=2）而检测的患者被排除，得到最终队列439名受试者。检测中位年龄为9.7岁，性别分布平衡。队列的种族/民族构成反映了医院癌症和血液学中心的组成。

检测适应证涵盖36个重叠类别。AA是最常见的，重度（n=107）、轻度（n=103）和中度（n=37）病例占队列的56.3%（n=247）。另外16.2%（n=71）因未明原因血细胞减少且无 documented 骨髓异常而检测；8.7%（n=38）因血细胞减少伴其他特征（如发育异常、自身免疫、器官受累）而检测；5.9%（n=26）因骨髓增生异常综合征而检测。总体而言，血液疾病单独或伴其他特征占TL检测的87.0%。值得注意的是，3.9%（n=17）的检测是通过综合检测偶然发现TBD基因中的P/LP变异或VUS而 prompted。

使用TL无关评分系统对TBD进行分类

为评估基础和详细Flow-FISH检测的诊断性能，应用了TBD的TL无关评分系统。评分1分用于（1）TBD基因中的P/LP变异或（2）BMF伴主要临床特征（如皮肤黏膜三联征、肺或肝纤维化、肝肺综合征、渗出性视网膜病变或小脑发育不全）或TBD家族史。未将TBD基因中的VUS评分，因为这会在无证据的情况下将其加权为致病性。总分1或2定义为TBD诊断；0分表示非TBD。基于此系统，23名受试者（5.2%）被分类为患有TBD。其中，16人有TBD基因的P/LP变异，三人有TBD基因的VUS。四人被分类为TBD但未识别出变异，可能 due to 基因发现 limitations。例如，两人在仅知六个TBD基因时接受检测。

值得注意的是，无一携带P/LP变异或VUS的个体在TL检测时符合SAA标准，而一名无遗传诊断的个体符合。这对应于SAA患者中TBD分类率<1%（1/107），而MAA为8.1%（3/37），mAA为9.7%（10/103）。尽管贫血和血小板减少在各组中常见，但中性粒细胞减少在TBD分类个体中较少见。

因偶然遗传发现而检测的组中，按复合评分分类为TBD的比例最高（三人有P/LP变异），但大多数有VUS且未被分类为TBD。在14名有VUS的个体中，仅一人有VL TL，且 across all leucocyte subsets。该个体携带杂合NHP2和RTEL1 VUSs，遗传自未患病父亲，诊断为难治性免疫性血小板减少症，一种尚未通过Flow-FISH系统研究TL的疾病，尽管一项使用qPCR的研究报告受影响个体TL较短。

AA患者TL概述

分析聚焦于诊断为不同严重程度AA的受试者。TL分类为VL、L、N、H和VH。 across all AA亚型，在所有白细胞亚群中，TL分类为VL或L的比例高于基于正态分布的预期，尤其在粒细胞中，16%–46%的病例TL为VL，16%–25%为L。18%–45%的病例粒细胞数量不足无法分析（总体28%），限制了进一步评估。 together，这些发现可能反映了AA中淋巴和髓系谱系复制压力增加，导致端粒加速缩短。

在107名SAA受试者中，七人（6.5%）淋巴细胞TL为VL。值得注意的是，这七人中有四人患有肝炎相关SAA（HA-SAA），占20例HA-SAA病例的20%，而其他三人仅占87例非HA-SAA病例的3.4%，这一差异与先前报告一致。五名个体（三名非HA-SAA和两名HA-SAA）在≥3淋巴细胞亚群中观察到VL TL。仅一名SAA受试者（0.9%）符合TBD标准（基于BMF加肺纤维化）。其淋巴细胞和所有淋巴细胞亚群TL为VL。重要的是，在此SAA队列中，单独淋巴细胞TL测量识别了所有在≥3淋巴细胞亚群中也有VL TL的个体。

在37名MAA受试者中，五人（13.5%）淋巴细胞TL为VL。其中，四人也在≥3淋巴细胞亚群中有VL TL。五人中三人因携带TBD基因致病变异（PV）被分类为TBD。其余两人，分类为非TBD，尽管全面遗传分析，缺乏TBD基因P/LP变异或VUS。与SAA队列不同，一名MAA受试者在四个淋巴细胞亚群中的三个（记忆T、B和NK细胞）表现出VL TL，但总淋巴细胞仅L TL。其被分类为非TBD，且无TBD基因变异。TL检测在SARS-CoV-2感染后长时间血细胞减少后进行。值得注意的是，该受试者有6p拷贝中性杂合性丢失，一种与免疫介导AA相关的发现。

mAA组中VL TL病例的比例和数量最高。在此103名个体中，18人（17.5%）淋巴细胞TL为VL，15人（14.6%）在≥3淋巴细胞亚群中TL为VL。十名受试者（9.7%）被分类为患有TBD，包括七人（6.8%）有TBD相关基因的P/LP变异。与MAA组类似，一名mAA受试者在四个淋巴细胞亚群中的三个（记忆T、B和NK细胞）有VL TL，但总淋巴细胞为L TL。该个体后来被诊断为Shwachman-Diamond综合征（SBDS突变）。

总体而言，在mAA和SAA中，VL淋巴细胞TL检测≥3淋巴细胞亚群中VL TL的敏感性高（分别为93%和100%），但在MAA中仅为中等（80%）。然而，MAA组仅五人，限制了可解释性。

Flow-FISH在识别不同AA严重程度TBD中的诊断性能

评估了VL淋巴细胞TL与≥3淋巴细胞亚群（在Alter等人中具有最佳检测性能）在识别不同AA严重程度TBD中的诊断性能。与复合评分分类的TBD相比，两者敏感性 across all AA亚型均为100%。

VL淋巴细胞TL的特异性在mAA中为91.4%至SAA中94.3%。SAA中PPV低（14.3%），但MAA和mAA中为中等（分别为60.0%和55.6%）。≥3淋巴细胞亚群中VL TL的特异性略高，从MAA的94.1%至SAA的96.2%，PPV增加更多（SAA至20%，mAA至66.7%）。

使用Cohen's kappa统计量评估两种TL检测方法的一致性。SAA和mAA的一致性“几乎完美”（κ=0.82, p<0.001），MAA为“实质”一致性（κ=0.77, p<0.0011）。

考虑了结合VL粒细胞和淋巴细胞TL是否改善检测性能。总体而言，影响可变。例如，与单独VL淋巴细胞TL相比，VL淋巴细胞和粒细胞TL对mAA病例中TBD的敏感性较低。相反，SAA病例中PPV从14.3%增加至25.0%，且优于≥3淋巴细胞亚群中VL TL（20.0%），尽管PPV仍低。总体而言，在具有最多TBD病例的AA亚群mAA中，≥3淋巴细胞亚群中VL TL的检测性能优于单独淋巴细胞以及淋巴细胞和粒细胞。重要的是，由于大量患者（初始439名患者队列中的123名；28%）粒细胞TL测量因数量不足而缺失，无法得出可靠结论。

无AA患者中Flow-FISH检测性能

将分析扩展至其余192名TL检测时无AA/BMF诊断的个体。与此AA患者相比，该队列的临床特征 described。在无AA的个体中，九人因携带TBD相关基因的P/LP变异被分类为患有TBD，三人仅以遗传学为标准。九人中，五人淋巴细胞表现出L TL，但无人在≥3亚群中显示VL TL。五人中三人有 confirmed or suspected de novo 连续基因缺失，包括两人有5p缺失涵盖TERT基因，与此类缺失第一代中观察到的有限端粒缩短一致。这种有限缩短程度与在所有 also had AA/BMF的14名分类为TBD的受试者中淋巴细胞和 across ≥3亚群中观察到的VL TL形成对比。这些结果支持端粒缩短及 resulting 端粒功能障碍驱动TBDs中的BMF，而非基因缺陷本身。反映这些发现，VL淋巴细胞TL、≥3淋巴细胞亚群及淋巴细胞和粒细胞TL的检测性能在无AA者中低于有AA者，且敏感性和PPV显著降低。

讨论

TL检测推荐用于年龄≤40岁的SAA个体，以支持疾病分类和指导治疗决策。在此大型单机构队列中，发现基于VL淋巴细胞TL的敏感性和特异性足够高，以识别表现为SAA的罕见TBD病例，并限制此人群中因假阳性导致的不必要随访检测。尽管≥3淋巴细胞亚群中VL TL增加了PPV，但SAA队列中TBD患病率极低。因此，结果挑战了是否必须在表现为经典SAA无其他TBD特征的年轻患者开始治疗（如IST）或其规划（如HSCT）前 resulted TL。

有趣的是，TBD患病率在MAA或mAA患者中最高，在评估时mAA患者中接近10%，突出了将TBD纳入这些患者鉴别诊断的重要性。尽管大多数MAA或mAA患者无其他会 prompt 转诊的特征，但不能排除存在偏向具有TBD特征患者的可能性。尽管VL淋巴细胞TL识别了所有有潜在TBD的MAA和mAA患者，但≥3淋巴细胞亚群中VL TL在整体AA组中提供了改进的特异性和PPV，且在mAA组中程度最大。推测，尽管免疫介导AA中可能发生加速端粒缩短，但影响在淋巴细胞亚群中不成比例，与TBDs中观察到的全局缩短形成对比。这些发现表明，详细检测可用于更好识别那些需要进一步TBD评估（如基因检测）的AA患者。

本研究的一个限制是部分患者缺乏或不充分的基因检测。即使有全面分析，解释也受尚未认识的TBD相关基因限制。因此，一些TBD个体可能因仅依赖临床标准而被错误分类。

此外，疾病 anticipation 和年龄依赖性出现的TBD相关特征使诊断复杂化。TBDs的病理生理学由临界短端粒驱动，而非遗传变异本身。在常染色体显性病例中，端粒缩短可能代代恶化。因此，携带 de novo PVs的年轻个体，如TERT基因，可能不表现出VL TL，且临床表现可能仅在成年后期出现。

TBD相关基因中识别出的约一半变异分类为VUSs。尽管一些可能最终被重新分类为P/LP，但值得注意的是，四名有VUSs且淋巴细胞或≥3淋巴细胞亚群中VL TL的个体中，三人临床诊断为TBD。这突出了端粒Flow-FISH在变异解释和分类中的潜在作用。

重要的是，这些发现不适用于首次表现为TBD的成人，因为先前研究显示，TL高于第一百分位数的TBD患者比例随年龄增长而增加，涵盖 nearly all 超过60岁的个体。尽管如此，结果为评估年轻AA患者提供了宝贵指导，其中约5%可能有潜在TBD。