巨核细胞与血小板转录组分析在GP9和IKZF5相关血小板减少症中的应用研究

本文通过建立GP9?/?和IKZF5WT/Y121F突变型永生化巨核细胞系（imMKCL），系统分析了巨核细胞分化过程中及患者血小板中的转录组变化，揭示突变导致RNA代谢、细胞骨架折叠和细胞周期通路异常，为遗传性血小板减少症的机制研究和临床诊断提供新视角。

　　

引言

血小板在维持机体止血功能中发挥关键作用，它们由骨髓中的巨核细胞（MKs）产生并释放至血液循环。尽管血小板为无核细胞，但仍携带来自巨核细胞的RNA转录本，这些转录本在血小板生成过程中被转移至血小板内。然而，由于伦理和技术限制，人类巨核细胞与血小板转录组之间的对应关系尚不明确，尤其在遗传性突变导致血小板形成缺陷或血小板减少症的背景下更为复杂。本研究聚焦于两种致病突变——GP9纯合缺失（GP9^?/?）和IKZF5杂合Y121F变异（IKZF5^WT/Y121F）——对巨核细胞和血小板转录组的影响，旨在揭示遗传性血小板减少症的分子机制。

材料与方法

研究利用CRISPR/Cas9技术构建了GP9^?/?和IKZF5^WT/Y121F突变的永生化巨核细胞系（imMKCL），并通过流式细胞术、免疫印迹和明亮视野显微镜评估细胞分化、表面标志物表达、倍性分布及前血小板形成能力。同时，采集健康对照者和血小板减少症患者的外周血样本，进行RNA提取和转录组测序（RNA-seq）。数据分析采用MMSEQ进行基因表达定量，使用多分类模型（MMDIFF）识别差异表达基因（DEGs），并通过Reactome数据库进行基因集富集分析（GSEA）。

结果

临床与遗传特征

三名血小板减少症患者经多基因panel测序确诊。患者A-II.1和A-II.2为近亲结婚所生的同胞，患有Bernard–Soulier综合征（BSS），其GP9基因存在纯合缺失，表现为出血、巨血小板减少症及血小板表面GPIX（CD42a）和GPIbα（CD42b）表达缺失。患者B-II.1携带IKZF5基因的Y121F新生杂合变异，表现为轻度血小板减少和出血症状。HEK293细胞转染实验证实IKZF5 Y121F变异导致染色质结合能力受损。

功能表征

GP9^?/?巨核细胞在分化第4天完全缺失GPIX表达，ITGA2B（CD41a）表达轻度降低，倍性分布无显著改变，但前血小板形成能力平均降低96%。IKZF5^WT/Y121F巨核细胞的CD41a和CD42a表达水平与野生型（WT）无显著差异，倍性分布正常，但前血小板形成能力平均降低57%。

转录组效应

血小板RNA-seq分析显示，GP9^?/?患者血小板中存在1540个差异表达基因（325个上调，1215个下调），而IKZF5患者血小板中存在3541个差异表达基因（1379个上调，2162个下调）。GSEA分析发现，下调基因显著富集于“血小板活化、信号传导与聚集”通路。

时间依赖性转录组变化

主成分分析（PCA）表明，健康个体血小板转录组与分化中期（第2-3天）的巨核细胞相似，而血小板减少症患者的血小板转录组更接近早期巨核细胞。多分类模型分析显示，GP9^?/?突变影响2429个基因的表达，其中1841个基因的表达变化呈时间依赖性（Model 4），而IKZF5^WT/Y121F突变影响1053个基因，其中752个基因的表达变化呈时间独立性（Model 3）。

通路富集与验证

GP9^?/?巨核细胞中，早期和晚期下调基因分别显著富集于RNA代谢通路、微管/肌动蛋白折叠通路（如CCT/TriC复合体）。IKZF5^WT/Y121F巨核细胞中，下调基因显著富集于细胞周期通路。RT-qPCR和流式细胞术验证了这些通路关键基因的表达改变及细胞周期缺陷。

转录组镜像关系

GP9^?/?巨核细胞中鉴定的RNA代谢和细胞骨架相关下调基因，在患者血小板中同样下调；而IKZF5^WT/Y121F相关的细胞周期下调基因中，仅部分在患者血小板中下调，提示巨核细胞成熟状态的转录组补偿效应。

讨论

本研究首次利用imMKCL模型联合患者血小板转录组数据，系统揭示了GP9和IKZF5突变导致血小板减少症的分子机制。GP9缺失通过破坏RNA代谢和细胞骨架折叠通路影响巨核细胞成熟和前血小板形成，而IKZF5突变则通过干扰细胞周期调控导致血小板生成障碍。结果表明，血小板转录组异常不仅源于突变本身的直接效应，还受到巨核细胞分化障碍和RNA转移受损的间接影响。研究为遗传性血小板减少症的机制探索提供了新视角，并强调了联合分析巨核细胞与血小板转录组在疾病研究中的重要性。

作者贡献

Koenraad De Wispelaere负责概念设计、数据分析与论文撰写；Fabienne Ver Donck、Kato Ramaekers和Chantal Thys参与实验与验证；Koji Eto提供资源支持；Veerle Labarque负责项目管理与资源协调；Ernest Turro和Kathleen Freson指导研究设计、资金获取与论文修订。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

伦理批准

研究经UZ Leuven伦理委员会批准（S63666），所有参与者均签署知情同意书。

资助信息

研究受KU Leuven BOF、FWO、NIH、BAEF及ERN-EuroBloodNet等项目资助。