患者特异性药物基因组学揭示xCT（SLC7A11）作为结肠癌的预测性治疗靶点及其在肿瘤连接性中的潜在意义

本研究通过整合32例结肠癌（CRC）患者的mRNA测序数据，结合CRISPR筛选和患者来源类器官（PDO）功能验证，揭示xCT（SLC7A11）为核心的Xc?系统在肿瘤代谢重编程、化疗响应和铁死亡（ferroptosis）调控中的关键作用，为CRC个体化治疗提供了新靶点和预测策略。

　　

2 方法

2.1 32例CRC患者的RNA-seq分析

通过对比32例西方高加索裔结肠癌患者的癌组织与邻近健康组织样本（共73个样本，36个肿瘤T和37个健康H），进行配对mRNA测序分析。健康组织取自结肠切除标本的远端边缘（距原发肿瘤至少5-7cm），经病理学家确认无肿瘤细胞污染。研究遵循赫尔辛基宣言，并获得当地伦理委员会批准（#33/01）。

2.2 公共资源中CRC患者分析

使用Limma R包（Ver 4.2.0）进行差异表达分析，调整P值<1e-20为显著性阈值。利用GEPIA2数据库（整合TCGA和GTEx数据）进行验证，并通过箱型图、小提琴图和散点图可视化选定差异表达基因（DEGs）。

2.3 结肠细胞类型分析

基于GTEx和人类蛋白质图谱（HPA）数据，分析15个人体器官的细胞类型富集情况，聚焦7种主要结肠细胞类型（如结肠肠上皮细胞、肠内分泌细胞等）和5种免疫细胞类型（如巨噬细胞、T细胞等）。

2.4 生物信息学工具与统计学

采用配对双尾t检验、Mann-Whitney U检验和Kruskal-Wallis检验进行组间比较，P<0.05视为显著。使用Benjamini-Hochberg方法计算错误发现率（FDR），超几何分布检验用于基因集重叠分析。基因表达密度图基于TCGA、TARGET和GTEx数据通过TNMplot生成。富集分析使用MSigDB中的Hallmark基因集（50个主要细胞过程），miRNA富集基于miRinGO和dbDEMC 3.0数据库。

2.5 相互作用网络

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络基于IntAct数据库（高置信度MI评分），STRING网络用于PPI置信度评分（>0.6）。miRNA-基因调控网络从EMT-Regulome提取。

2.6 CRISPR-Cas9细胞系筛选

利用DepMap中的CRISPR/Cas9筛选数据（19,144个基因，1206个细胞系），分析基因依赖性。通过CRISPR-Cas9项目（Public 23Q4 + Score, Chronos资源）预计算COAD中的富集依赖性基因。

2.7 基于基因表达水平的预测分析

使用KM Plot和ROC Plotter整合基因表达数据（RNA-seq和Chip-Seq）与化疗响应数据，生成ROC曲线评估基因与治疗响应的相关性。通过MuTarget的GENOTYPE模块分析TCGA COAD样本中基因集的破坏性突变。

2.8 COAD和健康结肠患者来源类器官（PDO）建立

新鲜切除的组织样本经病理确认后，健康结肠黏膜分离成1-2mm片段，通过EDTA处理释放隐窝。CRC组织通过胶原酶IV和Dispase消化成单细胞悬液。隐窝或肿瘤细胞重悬于Cultrex BME中，接种于预温板中，使用结肠扩张培养基（含R-spondin-CM、Noggin-CM等因子）培养。健康类器官添加NGS-Wnt重组蛋白（1nM）。研究获马格德堡大学医学院伦理委员会批准（#46/22）。

2.9 PDO的DNA质量控制

类器官收获后使用QIAamp DNA Mini Kit提取DNA，通过Nextera Rapid Capture Custom Enrichment panel（Illumina）进行靶向测序，覆盖目标基因的所有编码外显子和侧翼内含子序列（±20核苷酸）。使用varvis基因组学软件（v.1.25.0）进行SNV和CNV分析，覆盖深度>100×。定期通过短串联重复（STR） assays和商业PCR-based支原体检测确保细胞模型的遗传真实性和无污染。

2.10 流式细胞术评估表面表达和PDO代谢

制备PDO单细胞悬液（5例结肠癌，2例健康供体），使用活力染料（Ghost Dye? Violet 510）和荧光标记抗体（如抗CD44、抗CD71、抗SLC7A11/xCT）染色。胱氨酸摄取使用BioTracker Cystine-FITC Live Cell Dye（0.5μM）检测，不稳定铁池（Fe²⁺）使用Phen Green SK diacetate（10nM）测量。数据在NorthernLights光谱流式细胞仪上记录，通过FlowJo V10分析。

2.11 通过发光法细胞活力定量分析药物对PDO的影响

类器官扩增后（传代8-15次），通过TrypLE Express消化成单细胞，过滤后重悬于BME中，接种于96孔板（2000细胞/孔）。培养3天后形成类器官，添加药物（如5-FU、Erastin）处理72小时，使用Cell Titer-Glo 3D试剂测量活力。

3 结果

3.1 结肠癌患者的配对样本分析

无监督聚类和PCA分析（基于前1000个DEGs）成功区分肿瘤（T）和健康（H）样本（图1A、B）。火山图显示DEGs的显著上调和下调（图1C）。Hallmark基因集富集分析（如G2/M检查点、E2F靶标）与GEPIA2外部数据一致（图1D、E），确认癌症相关信号。

3.2 结肠癌DEGs揭示细胞周期和代谢程序的特征

最富集的Hallmark sets（调整P值<1e-05）包括细胞周期相关（如E2F靶标、G2/M检查点）和代谢程序（如脂肪酸代谢、外源性代谢）（表1）。上调基因与细胞周期和mTOR信号通路重叠（图2A），下调基因富集于代谢过程。

3.3 上调基因识别有丝分裂细胞亚群

130个显著上调基因与HPA分类的12种细胞类型比较，仅与有丝分裂细胞类型显著重叠（23个DEGs，富集P值3.5e-05）（图2B），涉及染色体分离（KIF2C等）、DNA修复（RAD51AP1等）和检查点控制基因（TPX2等）。免疫相关细胞类型中仅DDX21被检测到。

3.4 最强DEGs中细胞外和质膜蛋白编码基因的富集

84个DEGs（FC>|5|）中80%下调，20%上调（图2C）。STRING网络（置信度≥0.5）显示最大子网（10节点）包括SLC7A11、线粒体功能基因和分泌细胞因子（图2D）。70%连接基因富集于细胞外区域（GO，P=3e-06）或质膜区域（P=0.003）。6个转运蛋白 among上调基因，SLC7A11最显著上调（表S3）。密度图分析（TCGA数据）验证所有84个DEGs的表达趋势（图2E、F）。

3.5 SLC7A11及其互作因子在CRC中协调上调表达

SLC7A11的直接互作伙伴（IntAct，MI评分>0.5）包括SLC3A2、CD44等（图3A）。SLC7A11、SLC3A2和CD44在T vs. H中显著增加（图3B）。TCGA数据中SLC7A11在COAD和READ样本中显著过表达（图3C）。SLC7A11核心集（16基因，STRING置信度≥0.7）包括转运蛋白（如SLC家族）、代谢基因（如OTUB1、BECN1）和癌症进展相关基因（如TP53、EGFR）（图3D）。密度图显示多数核心基因在肿瘤中表达更高，但SLC1A2、EGFR和ATF4呈相反趋势（图3E）。16基因签名显著区分TCGA COAD队列中的肿瘤与健康组织（图3F）。

3.6 基于知识的SLC7A11检查确定其致癌潜力

CRISPR共依赖性分析显示Xc?系统（SLC7A11、SLC3A2）和CD44的 top 100相关基因重叠较小，仅SDHA共享（图4A）。SLC7A5与SLC3A2共享63个基因。17项肠癌研究（8041样本）中，4.2%样本携带27个共享基因集的截短突变。突变组的总生存（OS）和无进展生存（PFS）显著改善（图4C、D），表明SLC7A11及其相关基因集下调与生存改善相关。

3.7 使用^{in silico}方法分析Xc系统中基因依赖性的功能分析

MuTarget分析（基于破坏性突变）显示，在SLC7A11、SLC3A2、ATIC、TFRC和UMPS（FunSet）功能丧失的样本中，SELENBP1和SGK2下调，OXCT1上调（图5）。这些基因涉及代谢调控和上皮-间质转化（EMT）。GO注释富集显示上调基因与免疫响应相关，下调基因与细胞稳态过程相关。

3.8 xCT及其互作因子的差异蛋白表达决定PDO模型中的化学敏感性和铁死亡

流式细胞术显示肿瘤与健康类器官间xCT表面表达无显著差异，但肿瘤类器官细胞内胱氨酸浓度显著较低，游离Fe²⁺较高（图6A、B）。xCT表达与TFRC水平正相关（r=0.88），与CD44负相关（r≈-0.77）。CD44与细胞内Fe²⁺水平负相关（r=-0.8）（图6C）。PDO药敏试验显示对5-FU和Erastin的差异响应（图7A）。xCT高表达与Erastin（r≈0.95）和5-FU（r=0.97）敏感性正相关，CD44高表达与两者疗效负相关（图7B、C）。

4 讨论

SLC7A11异常激活通过影响氧化还原平衡、代谢灵活性、免疫功能和铁死亡参与多种癌症。本研究聚焦Xc?系统在CRC中的作用，发现独特的DEG簇连接有丝分裂特征与xCT特异性细胞代谢。CRISPR筛选支持SLC7A11与TFRC等基因的共依赖性，突变分析表明其与改善生存相关。PDO功能实验揭示xCT表达与化疗敏感性相关，挑战了xCT上调通常 confer耐药的传统观点，提示在某些条件下可能增敏治疗。局限性包括类器官培养偏倚和缺乏肿瘤-free参考数据集，需更大样本验证。

5 结论

尽管PDO中未观察到xCT表达差异，但较高xCT水平与化疗响应改善相关，支持xCT作为预测生物标志物。建议CRC患者治疗前筛查xCT活性，分层指导化疗。联合xCT抑制剂可能改善标准治疗疗效。xCT可能调节癌症细胞与神经元微环境的相互作用，值得进一步研究。