一种罕见的造血干细胞来源的巨核祖细胞通过增强的生存能力积累并导致衰老过程中血小板生成加剧

本研究发现，衰老过程中造血干细胞（HSC）可通过非经典路径直接产生独特的巨核祖细胞（ncMkP）。这些ncMkP（CD48-CD321+）展现出增强的生存能力（BCL-2高表达）和血小板生成功能，导致高反应性血小板（P-selectin暴露增加）产生，揭示了年龄相关血栓性疾病（如心血管疾病）的新细胞机制和潜在治疗靶点（如CD48/CD321）。

　　

ABSTRACT

衰老伴随造血系统的显著变化，导致血细胞输出和功能的改变。血小板介导的心血管疾病是主要的年龄相关健康问题。传统观点认为血小板经由造血干细胞（HSC）通过多能祖细胞（MPP）、共同髓系祖细胞（CMP）、巨核细胞-红系祖细胞（MEP）最终生成巨核祖细胞（MkP）和血小板的经典路径产生。然而，近期研究发现，在衰老过程中存在一条额外的、渐进的血小板生成“捷径”路径，即HSC可直接指定产生MkP（非经典ncMkP），并最终生成功能亢进的血小板，这可能是年龄相关血小板介导的发病机制的关键贡献者。

Abbreviations

本研究涉及的关键缩写包括：骨髓（BM）、转录组和表位细胞索引（CITE）、经典巨核祖细胞（cMkP）、非经典巨核祖细胞（ncMkP）、造血干细胞（HSC）、单细胞RNA和CITE测序（scRNA/CITEseq）等。

1 Introduction

衰老人群发生多种疾病的风险增加，这些疾病与造血功能的年龄相关性改变有关。理解造血衰老的原因和后果对于改善健康衰老至关重要。血小板由造血干细胞和祖细胞（HSPC）在骨髓中持续产生，介导血液凝固、伤口愈合和免疫反应。随着年龄增长，血小板数量的改变和更低的激活阈值共同导致了在老年人群中常见的血小板介导的疾病。尽管有大量靶向血小板的药物，心血管疾病仍然是导致死亡的主要原因，这凸显了对衰老特异性血小板生成机制新见解的迫切需求。

2 Results

2.1 Aged MkPs Exhibit Distinct Molecular and Phenotypic Heterogeneity

年龄渐进性的Tom⁺ MkP（来自FlkSwitch老年小鼠）与GFP⁺经典对应物相比，表现出显著的分子、表型和功能差异。通过多模式数据分析（包括已发表的批量RNA测序和单细胞RNA测序数据），确定了在衰老GFP⁺和Tom⁺ MkP之间差异表达的细胞表面蛋白候选物。最终，CD48（在衰老GFP⁺ MkP上高表达）和CD321（在衰老Tom⁺ MkP上高表达）被确定为能够高效富集这两种群体的关键标志物。

2.2 CD48 and CD321 Coordinately Enrich for Aged Tom?+?MkPs

CD48和CD321的组合使用能够高效地富集衰老FlkSwitch小鼠中的GFP⁺和Tom⁺ MkP。CD48⁺CD321^- MkP被定义为经典MkP（cMkP），而CD48^-CD321⁺ MkP被定义为非经典MkP（ncMkP）。这种分类方法忠实地再现了衰老MkP区室的特性，包括ncMkP数量随年龄增长而扩增。

2.3 Expression of CD48 Protein, but Not RNA, Enriches for Aged GFP+ and Tom?+?MkPs Transcriptomically

对scRNA/CITEseq数据的额外注释分析表明，基于CD48蛋白（而非RNA）表达对衰老MkP进行分层，能最好地在转录组层面再现GFP⁺和Tom⁺亚群。GO Term分析显示，与HSC稳态、增殖和激活相关的类别存在重叠，进一步支持了cMkP和ncMkP命名法在转录组层面再现其对应物的稳健性。

2.4 Young Mice Possess Rare ncMkPs

在年轻（2-3月龄）小鼠中也检测到一个罕见但稳定存在的ncMkP群体，约占MkP总数的20%，其频率显著低于老年小鼠。CD321和CD24a在富集MkP亚群时可以互换使用。MkP的异质性存在于年轻成年小鼠中，并且ncMkP池在衰老过程中特异性扩增。

2.5 Female Mice Exhibit Modestly Reduced Effects of Aging to the Megakaryocytic Lineage

雄性和雌性野生型小鼠在不同年龄组的MkP总数和骨髓频率上相当。随着年龄增长，两性的ncMkP均发生扩增，但雌性小鼠的外周血血小板计数始终低于雄性同类，并且年龄相关的血小板数量扩增程度也较低。

2.6 ncMkPs Uniquely Gain Survival, but Not Proliferative, Advantage With Age

体外恢复实验显示，与所有其他MkP亚群相比，老年ncMkP recovered viable cell counts显著更高，年轻ncMkP则没有这种功能优势。细胞周期追踪和体外存活率评估表明，老年ncMkP特异性地拥有生存优势，而非增殖优势。MkP亚群的增殖和生存功能可能是解耦的。

2.7 ncMkPs Are Functionally Distinct From cMkPs In Vivo and Demonstrate Enhanced Function During Aging

体内增殖（Ki-67, EdU掺入）和存活（BCL-2蛋白水平）分析显示，年轻和老年cMkP及ncMkP之间没有显著差异。移植实验表明，老年ncMkP在体内具有独特的增强功能，能瞬时产生更多的血小板。年轻和老年ncMkP在移植背景下均能产生红细胞和粒细胞/单核细胞（GM），表明它们的功能不同于cMkP对应物。血小板功能分析显示，只有来自老年FlkSwitch小鼠的Tom⁺血小板是独特的高反应性的。

2.8 Aged, but Not Young, HSCs Efficiently Produce ncMkPs

体外培养实验表明，老年HSC能特异性地产生更多的ncMkP，而年轻和老年CD41^-髓系祖细胞（MyPros）几乎只产生cMkP。将老年HSC移植到年轻受体体内后，其产生的cMkP:ncMkP比率恢复为年轻稳态水平，表明衰老环境影响了MkP亚型的指定。单细胞HSC培养实验表明，ncMkP的产生并非完全由克隆限制性的HSC产生，一些年轻的单个HSC克隆能产生两种亚型。常用的表型标记 among murine HSC并不能预测体外MkP亚型的产生。

3 Discussion

本研究揭示了年轻和老年MkP中新的分子、表型和功能方面，支持并扩展了先前的报告。cMkP/ncMkP范式是研究巨核细胞生成不同途径的强大方法，无需遗传谱系追踪小鼠模型。年轻和老年ncMkP在移植环境下均具有产生髓系细胞的能力，这对表型MkP（按目前定义）是单向血小板祖细胞的假设提出了挑战。关于年轻成年小鼠中MkP的分子和功能异质性的观点已有多项报道，但本研究通过多组学、表型和功能方法解决了其中一些不一致之处。老年ncMkP（Tom⁺）直接由HSC产生，而年轻ncMkP的细胞起源仍部分存疑。缺乏严格的HSC克隆限制性表明，环境或其他因素在MkP亚型分化途径中起作用。尽管雄性和雌性小鼠的MkP（及MkP亚群）数量和频率在整个生命周期中相当，但雌性小鼠的血小板扩增程度较温和。小鼠和人类在年龄相关的血小板偏态性方面可能是保守的，但ncMkP的平行和年龄依赖性产生机制是否适用于人类，以及是否可以作为治疗靶点来减轻或预防不良血栓事件，仍有待观察。

4 Online Methods

详细描述了小鼠品系、组织收集处理、造血干细胞和祖细胞富集、流式细胞术和细胞分选（包括各种染色方案）、单细胞RNAseq分析、CITEseq（样本制备、数据准备和质量控制、差异蛋白表达分析、额外注释、细胞表面MkP候选物选择）、体外培养（批量和单细胞）、MkP移植和HSC移植等实验方法。统计测试在图中图例注明，使用GraphPad Prism进行。