NIPT检测中16q21末端缺失的临床无关性溯源：FRA16B遗传性脆性位点所致

本文报道一例NIPT检测发现的16号染色体长臂末端缺失案例，经证实源于罕见常染色体脆性位点FRA16B的遗传。通过长读长测序技术解析其分子结构为>20 kb的AT富集微卫星重复序列。研究强调对NIPT中16q21缺失需谨慎解读，避免不必要的侵入性产前诊断，为脆性位点相关假阳性结果提供了重要分子依据。

　　

引言

基于大规模平行测序技术的无创产前检测（NIPT）通过量化母体循环中的游离DNA（cfDNA）， revolutionized了对唐氏综合征、爱德华兹综合征和帕陶综合征的产前筛查。其全基因组覆盖能力使检测不平衡结构染色体异常成为可能。然而，NIPT结果的解读常受限于无法单独通过cfDNA测序明确染色体异常的起源、范围和结构性质，例如局限于胎盘嵌合体（confined placental mosaicism）的情况。因此，在妊娠期间，必须通过绒毛膜绒毛活检或羊膜穿刺术进行确认性遗传诊断测试，以确定异常NIPT发现的临床相关性。

本文报道一例NIPT提示16号染色体长臂存在约25 Mb末端缺失的案例，该缺失随后在母体血液和口腔细胞（35%–45%的细胞）中被证实为嵌合体。值得注意的是，相同的嵌合缺失也出现在孩子身上，该孩子在经过平静的妊娠后足月健康出生。进一步分析表明，该缺失源于罕见常染色体脆性位点（RFS）FRA16B的表达，导致16q21处染色体脆性增加。孩子并非遗传了母体的缺失，而是遗传了母体的RFS，导致母子双方在16q21处脆性增加。

方法

一名35岁健康女性在妊娠12周时选择进行NIPT。NIPT作为荷兰普通人群产前筛查的全国性实施研究TRIDENT-2的一部分进行，该研究此前已有描述。研究获得了荷兰健康、福利和体育部的批准（许可证号1,017,420–153,371-PG），并得到了阿姆斯特丹VUMC医学伦理委员会的批准（编号2017.165）。获得了参与者的书面知情同意，包括收集和使用医疗保健提供者的医疗随访数据用于科学研究。NIPT使用VeriSeq NIPT Solution v2（Illumina）在母体血浆上进行，完全按照制造商方案进行。对于NIPT中的拷贝数变异（CNV） calling，使用了两种不同的算法，即VeriSeq-NIPT v2和WISECONDOR。

对血液培养物的GTG显带中期扩散进行核型分析，并使用针对16号染色体长臂亚端粒区域（16qtel, Abbott Molecular）的探针进行FISH，均按照标准程序进行。使用CytoscanHD阵列（Thermo Fisher Scientific）进行全基因组CNV分析，按照制造商方案进行。命名法根据ISCN 2020，并针对人类基因组构建GRCh37给出。

为了诱导RFS FRA16B，将0.50 mL肝素血加入到8 mL含有植物血凝素、胎牛血清、Glutamax（Gibco, Thermo Fisher Scientific）、青霉素-链霉素和肝素的标准细胞遗传学RPMI 1640培养培养基中。培养基补充有5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）至终浓度22.5 μg/mL，培养物在37°C下孵育96小时，之后对中期细胞进行核型分析。

使用牛津纳米孔技术（ONT）长读长测序，通过自适应采样对富集的FRA16B重复及其60-Kb侧翼序列进行测序。文库使用SQK-LSK114连接试剂盒制备，并使用PromethION流动池（R10.4.1）进行测序，按照制造商说明（ONT, Oxford, UK）进行。数据使用ONT wf-human-variation工作流程处理，并在Integrative Genomics Viewer (IGV) version 2.17.2中可视化。使用Tandem Repeats Finder（tandem.bu.edu/trf）默认设置分析长序列读取中扩展的AT富集微卫星重复。

结果

妊娠12周时的全基因组NIPT筛查结果提示存在16号染色体长臂大片段末端缺失，VeriSeq-NIPT v2和WISECONDOR算法均检出。统计显著值分别为WISECONDOR中的Stouffer's Z-score为-11.8，VeriSeq-NIPT v2中的单体性对数似然比（monosomy Log Likelihood Ratio）为139.8。缺失断点确定在染色体带16q21附近，VeriSeq中位于chr16:64.8 Mb左右，WISECONDOR中位于chr16:65 Mb左右。NIPT结果报告提示胎儿缺失。随后，对健康母亲外周血分离的DNA进行染色体微阵列分析，发现存在35%嵌合的16q21末端缺失，大小为25 Mb，与NIPT结果一致。微阵列-CNV结果通过核型分析得到证实，在分析的31个中期细胞中，有3个显示末端缺失46,XX,del(16)(q21)。对母亲口腔拭子的间期FISH显示，45%的细胞核中16q-亚端粒仅有一个荧光信号，证实了嵌合末端缺失。从这些结果得出结论，母亲携带有一个大的、25 Mb的 constitutionally 嵌合缺失，没有明显的临床表现。在遗传咨询期间，母亲告知在先前的一次妊娠中，其他地方进行的NIPT也报告了类似发现（数据不可用）。然而，对她2.5岁健康女儿的随访测试显示，血液分离的DNA的CNV谱正常。

当前妊娠过程平静，妊娠18周和20周的超声检查未发现胎儿任何结构异常。由于文献中未描述过16q21断点的非嵌合末端缺失，母亲被告知仅存在很小的残留风险，即由于遗传了母体缺失而分娩出杂合不平衡的孩子。她拒绝进行侵入性产前诊断程序并继续妊娠。足月分娩一名健康女婴。对女婴脐带血DNA的微阵列-CNV分析显示，25%的细胞中存在16q21末端缺失，其大小与母亲所见缺失相同。由于父母和后代中如此相同的大片段末端缺失嵌合体极为罕见，且无法用孟德尔遗传解释，我们对新生儿的脐带血进行了核型分析，并重新评估了母亲的核型图。值得注意的是，除了显示16q21末端缺失的中期细胞外，我们还在母亲和孩子的样本中一些中期细胞观察到16q21带脆性增加，这被解释为推定的罕见常染色体脆性位点FRA16B的表达。为了证实这一点，从母亲获取了新血液，在BrdU条件培养基中培养中期细胞。已知BrdU可在体外诱导FRA16B。这种BrdU条件培养显示，母亲26/96（27%）的细胞中出现FRA16B相关异常，而对照个体的100个细胞中未见异常（χ²-test p < 0.01），且其他母体染色体未见异常。BrdU处理母体细胞后的细胞遗传学发现包括16q21处的双链断裂、16q21处的染色体裂隙/延迟复制区域或缢痕、16q21末端缺失，以及偶尔出现的16q21至16qter区域的三射体染色体。因此，在母亲和孩子中检测到的大片段嵌合末端缺失可以通过存在携带RFS FRA16B的脆弱16号染色体来解释，而不是由于遗传了缺失。

随后，通过ONT长读长测序对母亲外周血分离的DNA进行测序，在核苷酸水平上进一步表征了扩展的FRA16B脆性位点。结果显示16q21处有一个超过20 kb大小的扩展，总共包含至少720个重复。扩展区域内近端区域的重复 motif 共识序列是一个35-mer的AT富集微卫星 motif，即ATATATTAGATATATTAGTAGATATAATATATAAT。扩展FRA16B中的远端重复扩展 motif 高度相似，但由一个28-mer组成，即ATATATTAGATGATGTAATATATAATAT。近端35-mer和远端28-mer重复的最小数量可分别确定为>270和>450，总共产生至少700个扩展重复，对应于>20千碱基对（kbp）的杂合扩展DNA序列。

讨论

本研究表明，应谨慎对待NIPT检测到的16q21断点末端缺失。在本案例中，此类缺失在孩子身上以嵌合形式得到证实，但源于临床无关的FRA16B脆性表达，该脆性位点遗传自健康母亲。多项研究报道FRA16B是一种无害的RFS。其在普通人群中的杂合子携带者频率相对较高，估计从0.97%到5.1%，纯合子携带者也不受影响。没有关于FRA16B携带者产生不平衡后代的报告，且FRA16B基因组区域不存在蛋白质编码基因。我们观察到的BrdU诱导的FRA16B表达水平与先前报告相似。然而，据我们所知，这是首次通过CNV和FISH分析直接定义杂合FRA16B携带者体内16q21末端缺失水平的研究。尽管血液和口腔粘膜中存在高比例的末端缺失细胞，但这25 Mb的嵌合缺失在母亲和女儿身上均无临床表型表达，证实了先前的研究，即FRA16B确实应被视为无害。

除FMR1/FRAXA外，关于RFS的知识可能并未广泛传播，因为大多数RFS没有临床后果，因此不属于遗传实验室的诊断组合。我们的案例说明，在全基因组分子检测时代，传统的细胞遗传学专业知识仍然至关重要。如果为了确认NIPT结果而进行了侵入性产前遗传检测，并且RFS在绒毛膜绒毛或羊水细胞中表达，那么检测到的大片段嵌合缺失可能被误认为是临床相关且 potentially actionable 的发现。因此，为了正确解读异常NIPT结果，细胞遗传学背景知识对于确定确认性测试的类型和待测试的组织至关重要。在本研究中，我们无法测试产前临床标本，但如果通过CNV分析在产前环境中检测到如此大的16q21末端缺失，我们建议对父母双方进行微阵列分析，随后进行核型分析和/或BrdU培养。

据我们所知，这是首次通过长读长测序技术表征RFS重复共识 motif 的报告。扩展的重复共识序列 motif 与Yu等人使用PCR和Southern blot方法为FRA16B报道的略有不同。造成这种差异的原因可能是技术性的，我们认为长读长测序对于测序此类超长重复更为优越。或者，个体间扩展序列的差异可能是造成轻微差异的原因。

RFS FRA16B是一个扩展的AT富集微卫星重复。扩展的FRA16B等位基因排斥核小体，因此具有很强的形成多个非B DNA发夹/茎环结构的倾向。这些二级结构通过停滞复制叉和暂停S期DNA聚合酶来干扰DNA复制。这种复制压力导致16q21处出现单链、未复制区域，从而增加了对双链断裂和缺失的易感性，这解释了细胞遗传学观察结果。

我们的研究与先前一份关于10号染色体长臂大片段末端缺失（即del(10)(q25)）的假阳性异常NIPT结果的报告显示出相似性，该缺失与无害RFS FRA10B的母体表达有关。FRA10B和FRA16B表达的分子基础高度相似，因为两者都是由AT富集重复扩展引起，并且两种RFS都可由BrdU诱导。FRA10B（10q25）和FRA16B（16q21）的微卫星重复 motif 具有高度序列相似性。NIPT中看到的16q21末端缺失的频率估计<1:100,000，远低于FRA16B携带者的估计人群频率。FRA10B也是如此，这表明要么只有极小比例的携带者具有足够水平的、可通过NIPT检测到的嵌合缺失，要么只有部分携带者表现出增加的脆性和末端缺失倾向，例如由于更长的扩展。此外，先前估计FRA16B人群频率的研究并未包括分子水平的证据，而是基于非嵌入DNA配体的培养和通过光学显微镜分析16q处的次级缢痕。然而，常见的脆性位点FRA16C（16q22.1）和FRA16D（16q23.2）存在于所有个体中，可能会干扰这种经典的细胞遗传学方法。

结论

我们通过长读长测序表征了FRA16B，并表明应谨慎解读NIPT中发现的大片段末端缺失，特别是对于10q25和16q21。对于此类特殊的NIPT案例，我们建议检查断点附近是否存在RFS，并在进行产前诊断测试时包括亲本测试。

致谢

我们感谢Nieke Houben分析NIPT数据，Ruth Dirckx和Ragonda Souren进行核型分析，Ineke van der Hamsvoord进行FISH分析，以及Celine Sijben进行微阵列-CNV分析。我们感谢荷兰NIPT联盟进行全国性的TRIDENT-2 NIPT实施研究。本研究未获得任何资助。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。