m6A修饰的环状RNA circNEK11通过miR-1236-3p/GPX2轴调控肝细胞癌进展的机制研究

本研究发现m6A修饰的环状RNA circNEK11在肝细胞癌（HCC）组织中显著上调，通过YTHDC1介导的胞质输出机制，以ceRNA模式吸附miR-1236-3p从而解除对GPX2的抑制，最终促进HCC细胞增殖、迁移并抑制凋亡。该研究揭示了circNEK11作为HCC诊断潜在生物标志物和治疗靶点的重要价值，为HCC复发机制提供了新的理论依据。

　　

3.1 circNEK11的鉴定与特征分析

通过高通量环状RNA测序技术对8对HCC组织与癌旁组织、2对非复发与复发HCC组织进行分析，筛选出在HCC组织中异常高表达且与复发密切相关的circNEK11（hsa_circ_0067347）。该环状RNA由NEK11基因的12、13、14和15号外显子反向剪接形成，通过Sanger测序验证其环化位点。分子特性研究表明：circNEK11在cDNA中能被发散引物特异性扩增，而在基因组DNA中无法扩增；其半衰期显著长于线性NEK11 mRNA；对RNase R酶处理具有抗性；通过核质分离实验和RNA荧光原位杂交（FISH）证实其主要定位于细胞质。

3.2 敲低circNEK11抑制HCC细胞恶性表型

使用特异性siRNA敲低circNEK11表达后（不影响线性NEK11 mRNA），CCK-8法和克隆形成实验显示HCC细胞增殖能力显著降低，EdU染色阳性细胞比例下降。Transwell实验表明细胞迁移和侵袭能力减弱，而annexin V-FITC/PI染色显示细胞凋亡率显著增加。这些结果证明circNEK11在体外具有促进HCC细胞恶性行为的作用。

3.3 过表达circNEK11促进HCC进展

通过慢病毒感染构建circNEK11过表达的HCCLM3和Hep3B细胞系。功能实验显示：细胞增殖速率加快、凋亡受抑制、迁移侵袭能力增强。体内实验进一步证实，circNEK11过表达显著促进裸鼠皮下移植瘤的生长速度和体积，Ki-67染色显示肿瘤细胞增殖指数升高。此外，肝脏原位移植瘤模型表明circNEK11过表达增强了HCC的肺转移能力。

3.4 circNEK11作为miR-1236-3p分子海绵

RNA免疫共沉淀（RIP）实验证实circNEK11与AGO2蛋白结合。通过生物信息学预测和RNA反义纯化实验筛选出miR-1236-3p、miR-6514-5p和miR-7847-3p三个候选miRNA。双荧光素酶报告基因实验验证只有miR-1236-3p能特异性结合circNEK11，且突变结合位点后该作用消失。RNA pull-down实验显示biotin标记的miR-1236-3p可显著富集circNEK11。值得注意的是，过表达miR-1236-3p不会导致circNEK11降解，表明二者为典型的海绵吸附关系。功能回复实验证实miR-1236-3p过表达可逆转circNEK11促癌效应。

3.5 circNEK11/miR-1236-3p/GPX2通路机制解析

通过TargetScan数据库预测和转录组测序数据整合，发现抗氧化基因GPX2（谷胱甘肽过氧化物酶2）是miR-1236-3p的潜在靶标。实验验证表明：miR-1236-3p过表达可降低GPX2 mRNA和蛋白水平；双荧光素酶报告基因实验证实miR-1236-3p通过结合GPX2 3'UTR区调控其表达。circNEK11表达水平与GPX2呈正相关，且过表达circNEK11可逆转miR-1236-3p对GPX2的抑制作用。敲低GPX2能抑制HCC细胞恶性表型，并阻断circNEK11的促癌作用，证实该通路的生物学功能。

3.6 m⁶A修饰调控circNEK11胞质转运

SRAMP数据库预测显示circNEK11存在m⁶A修饰位点。m⁶A RIP实验证实其确实发生甲基化修饰。RIP和RNA反义纯化实验证明circNEK11与m⁶A阅读蛋白YTHDC1结合。虽然敲低YTHDC1不影响circNEK11表达量，但核质分离实验显示其核内滞留显著增加，表明YTHDC1以m⁶A依赖方式促进circNEK11胞质输出。

4 讨论与展望

本研究首次揭示circNEK11在HCC组织（特别是复发组织）中显著高表达，其通过吸附miR-1236-3p解除对GPX2的抑制，从而促进HCC进展。GPX2作为抗氧化酶，可能通过调节活性氧平衡和多种信号通路（Wnt/β-catenin、PI3K/AKT）参与肿瘤耐药机制，提示circNEK11可能成为HCC靶向治疗的新突破口。值得注意的是，m⁶A修饰及其阅读蛋白YTHDC1调控circNEK11胞质定位的发现，为环状RNA的代谢调控提供了新视角。该研究不仅揭示了circNEK11作为HCC诊断标志物的潜力，更为针对circRNA-mRNA调控网络的精准治疗策略提供了理论依据。