RNA与DNA宏条形码技术在滤食性宿主中区分食源与内生物群落的挑战：死与生的鉴别困境

本综述探讨了利用环境DNA（eDNA）和环境RNA（eRNA）宏条形码技术区分滤食性贝类（如贻贝和海绵）体内食源性与内生物（如寄生虫和共生体）群落的挑战。研究通过平行测序比较发现，RNA检测灵敏度更高，能捕获更多生物多样性，但未能有效区分食源（死亡）与内生物（活体）信号。这为eRNA在生物监测中的应用提供了新见解，并指出了当前方法在分辨生态来源方面的局限性。

　　

1 引言

生物多样性监测因环境DNA（eDNA）宏条形码技术的出现而获益匪浅。该技术以非侵入、省时省力的方式，提供高分辨率的监测数据，广泛应用于水体、土壤、凋落物乃至空气等多种基质。近年来，滤食性生物如贻贝和海绵因其持续滤食活动，在体内积累大量环境遗传物质，成为生物多样性监测的新工具。然而，如何区分宿主摄入的食源性类群与体内寄生或共生的内生物类群，仍是当前研究的核心挑战。这一问题与环境DNA研究中无法区分活体与死亡生物DNA的普遍难题相呼应。环境RNA（eRNA）宏条形码被视为一种潜在解决方案，因其仅由代谢活跃的生物释放，可能更准确地反映生态系统的活体群落。本研究以两种滤食性贝类——海洋的紫贻贝（Mytilus edulis）和淡水的斑马贻贝（Dreissena polymorpha）为对象，通过平行RNA和DNA宏条形码分析，探讨能否利用核酸类型的差异区分食源与内生物信号。

2 材料与方法

2.1 采样

样本来自德国环境标本库（ESB），采样过程高度标准化。紫贻贝于1985-2020年间每两月在德国北海海岸采集，年度样本由6个月份样本混合而成；斑马贻贝于1999-2018年间每年在易北河采集。样本立即在低于-150°C的液氮气相中冷冻，去壳后软体组织经低温粉碎至90%以上颗粒粒径<200μm，形成均质物，并持续超低温保存。

2.2 核酸提取、扩增与测序

从33个紫贻贝和20个斑马贻贝样本中分别提取DNA和RNA。DNA采用CTAB法提取，RNA使用TRIzol试剂提取。RNA经反转录为cDNA后，针对核18S rDNA/rRNA区域设计引物进行扩增：紫贻贝样本扩增306bp片段（主要靶向藻类和原生动物），斑马贻贝样本扩增112bp片段（靶向藻类、原生动物和后生动物，并阻断宿主信号）。扩增产物经索引PCR后，使用Illumina MiSeq进行测序。

2.3 数据分析

原始数据经质量过滤、去重复、去嵌合体后，聚类为零半径操作分类单元（zOTU）。 taxonomic annotation通过BLASTn比对NCBI数据库完成。数据分析在R环境中进行，包括 taxonomic 过滤、读长标准化、α和β多样性计算等。为区分食源与内生物，研究基于文献制定了严格和宽松两种分类标准：严格标准仅纳入已明确记录的食源或内生物类群；宽松标准则包含可能的相关类群。

3 结果

3.1 α与β多样性比较

RNA测得的zOTU丰富度显著高于DNA（斑马贻贝：RNA 290-664，DNA 165-368；紫贻贝：RNA 375-698，DNA 157-319）。尽管RNA与DNA的zOTU丰富度呈显著相关，但Jaccard相异度分析显示DNA库的β多样性更高。约43-46%的zOTU由RNA和DNA共同检测到，41-44%仅由RNA检测到，而仅由DNA检测到的zOTU比例较低（斑马贻贝14.7%，紫贻贝9.7%）。共同检测到的zOTU占总读长的96%以上，表明它们在群落中占主导地位。

3.2 食源与内生物信号的检测

依据宽松标准，斑马贻贝样本中12%的zOTU被归类为食源，0.6%为内生物；紫贻贝样本中8.2%为食源，0.4%为内生物。绝大多数食源和内生物zOTU（64-86%）及近100%的读长由RNA和DNA共同检测到。仅由RNA检测到的食源zOTU比例较高（27-29%），而仅由DNA检测到的比例极低。RNA与DNA在读长丰度上显著相关，但两者在共享zOTU的相对读长上无显著差异。

3.3 taxonomic 组成

在斑马贻贝中，Trematoda（扁形动物）、Chlorophyceae（绿藻纲）和Coscinodiscophyceae（圆筛藻纲）在RNA和DNA中的读长比例相似；DNA中Heterotrichea（异毛纲）读长较多，而RNA中Cryptophyceae（隐藻纲）和Trebouxiophyceae（共球藻纲）读长比例显著较高。在紫贻贝中，Oligohymenophorea（寡膜纲）、Coscinodiscophyceae、Dinophyceae（甲藻纲）和Bacillariophyceae（硅藻纲）在两种核酸中比例相当；DNA中Ascetosporea（囊孢子虫纲）和Spirotrichea（旋毛纲）读长较多，而RNA额外检测到Chlorophyceae、Trebouxiophyceae和Mediophyceae（中型藻纲）等类群。

4 讨论

本研究结果显示RNA宏条形码的物种检测灵敏度显著高于DNA，否定了原假设（1）。这一差异可能源于单细胞生物（如浮游植物）体内RNA拷贝数远高于DNA，且rRNA稳定性较高，易于检测。然而，与假设（2）相反，RNA和DNA在检测食源与内生物信号时未表现出显著差异模式：两者均能有效检测这两类群，且读长丰度高度相关。这可能是因为：1）食源生物在摄入后仍可能保持短暂代谢活性或未被完全消化；2）rRNA的稳定性使其在死亡后仍可被检测；3）贝类持续滤食导致食源信号不断更新。此外，消化过程中核酸酶的降解作用、rRNA的稳定性以及标记基因的选择（如改用mRNA）都可能影响结果。本研究凸显了eRNA在生物多样性监测中的高灵敏度优势，但也指出当前方法在区分生态功能方面的局限性。

5 结论

尽管核糖体RNA未能可靠区分食源与内生物信号，但RNA宏条形码在揭示生物多样性方面展现出巨大潜力。未来研究需探索其他RNA标记（如mRNA）以及实验控制下的饲喂策略，以进一步提升生态来源分辨能力。eRNA与eDNA的联合应用将为生态系统监测提供更全面的工具。

作者贡献

H.K.设计研究；I.J.、L.F.和N.M.完成实验与数据分析；I.J.撰写稿件；所有作者参与修订。

致谢

感谢Karin Fischer的实验协助。研究由特里尔大学生物地理学系部门资金和德国环境标本库支持。

利益冲突

作者声明无利益冲突。