色氨酸代谢酶与犬尿喹啉酸在抗体介导性肾小球肾炎中的免疫调控作用及机制研究

本研究深入探讨了色氨酸（TRP）代谢途径关键酶（IDO1、IDO2、KMO）及其代谢产物犬尿喹啉酸（KYNA）在抗体介导性肾小球肾炎（GN）中的调控作用。通过构建肾毒性血清诱导的GN（NTS-GN）模型，发现IDO1缺失会加剧肾损伤和中性粒细胞浸润，而KYNA可通过抑制FcγR–Syk信号通路和VEGF分泌显著改善炎症反应。该研究揭示了TRP–KYNA通路作为先天免疫调控新靶点的潜力，为免疫代谢干预策略提供重要理论依据。

　　

引言

色氨酸（TRP）作为必需氨基酸，其95%以上通过犬尿氨酸途径代谢，该途径是体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）合成的唯一^{de novo}途径。吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）存在IDO1和IDO2两种亚型，是该途径的限速酶。近年研究发现该途径与免疫功能密切相关，包括IDO在妊娠免疫耐受中的作用、表达IDO的抗原呈递细胞通过色氨酸分解代谢调节T细胞活化、衰老和炎症中细胞固有NAD生成减少改变巨噬细胞免疫功能，以及恶性肿瘤通过IDO1表达实现免疫逃逸。IDO2则在B细胞中发挥关键作用，促进自身免疫发展。

在肾脏疾病领域，犬尿氨酸3-单加氧酶（KMO）缺失对缺血再灌注损伤模型的急性肾损伤（AKI）具有保护作用，而犬尿氨酸途径的末端酶喹啉酸磷酸核糖基转移酶（QPRT）对维持肾脏NAD水平和AKI抵抗至关重要。然而，关于TRP代谢在免疫介导性肾小球肾炎中的作用仍知之甚少，特别是对中性粒细胞——抗体介导性GN早期关键效应细胞的影响尚不明确。

材料与方法

研究使用8周龄成熟雄性小鼠，在无特定病原体环境中饲养。Ido1缺失小鼠（C57BL/6J背景）购自杰克逊实验室，Ido2和Kmo缺失小鼠（C57BL/6N背景）来自KOMP项目库。通过CRISPR/Cas9技术在C57BL/6N背景上删除Kat2基因第2外显子至第12-13内含子间的37,234 bp基因组区域，制备Kat2缺失小鼠。

采用肾毒性血清肾小球肾炎（NTS-GN）模型：小鼠在第-3天用兔IgG和完全弗氏佐剂预免疫，第0天静脉注射兔抗鼠肾小球基底膜血清。犬尿喹啉酸（KYNA）在NTS注射当天开始以10 μg/g剂量隔天腹腔注射，直至处死。

通过代谢笼收集尿液，下腔静脉采集血清，外包分析尿 albumin、尿肌酐和血清肌酐。肾组织学评估采用3 μm石蜡切片，PAS染色评估新月体形成和沉积物指数，酯酶染色评估肾小球中性粒细胞浸润。

体外实验采用免疫复合物（IC）刺激系统：将抗BSA抗体加入预包被BSA的培养板形成IC，将WT和各TRP代谢酶缺失小鼠的骨髓来源中性粒细胞接种于板上，监测5-60分钟内的形态变化。使用Opera Phenix高内涵筛选系统自动识别中性粒细胞核和胞质，基于罗丹明鬼笔环肽在核和核周区域的信号强度差异，将细胞分类为"铺展细胞"和"圆形细胞"。

结果

3.1 Ido1和Kmo缺失改变NTS-GN肾损伤严重程度

在NTS-GN模型中，Ido1缺失小鼠相比野生型（WT）表现出显著恶化的肾功能障碍，第14天血清肌酐和尿 albumin/肌酐比（UACR）显著升高（p=0.0048和p=0.0057），肾小球新月体形成和PAS阳性沉积物明显增加。Ido2缺失小鼠与WT无显著差异。Kmo缺失小鼠第14天新月体形成显著减少（p=0.0022），其他参数与WT相似。各组肾小球抗体沉积强度无差异。

3.2 TRP代谢酶缺失影响肾小球中性粒细胞浸润和形态变化

酯酶染色显示，第7天Ido1缺失小鼠肾小球中性粒细胞浸润显著高于WT。Ido2缺失小鼠无显著差异，Kmo缺失小鼠呈减少趋势。体外实验中，Ido1缺失中性粒细胞在IC刺激下更早激活并维持形态铺展，60分钟时铺展细胞面积显著大于WT和Kmo缺失细胞（p=0.0070和p=0.0025）。30和60分钟时铺展型中性粒细胞百分比显著高于WT（p=0.018和p=0.021）。

3.3 TRP酶缺失小鼠肾皮质犬尿氨酸途径代谢物水平改变

所有组TRP水平在疾病诱导后均升高，但各组间无显著差异。NTS-GN诱导前，Ido1缺失小鼠KYN水平显著降低（p=0.0086），KYN/TRP比也降低（p=0.0040）。肾炎诱导后KYN逐渐增加，第14天与WT相当。正常条件下Ido1缺失小鼠KYNA水平与WT相似（p=0.88），但第7天显著升高（p<0.001）。第14天仍高于WT但无统计学意义（p=0.058）。KYNA/KYN比在Ido1缺失小鼠中逐渐升高，而3HAA/KYN比未相应上升，表明TRP代谢优先转向KYNA而非3HAA分支。Ido2缺失小鼠KYN水平和KYN/TRP比与WT相当。Kmo缺失小鼠两种条件下KYN和KYNA水平均显著升高。

3.4 外源性KYNA改善Ido1缺失NTS-GN小鼠生存和肾损伤

PBS处理组所有小鼠第14天前死亡，而KYNA给药显著改善生存（log-rank检验，p=0.015）。第4和7天，KYNA治疗组肾小球中性粒细胞浸润显著减少（p=0.029和p=0.032）。第7天KYNA治疗组肾功能改善，血清肌酐（p=0.046）和UACR（p=0.0028）降低，新月体形成减少（p<0.001）。肾皮质KYNA浓度显著升高，KYN/TRP比也更高，表明KYNA治疗改变局部色氨酸代谢。抗体沉积无差异。

3.5 Ido1缺失小鼠加速的中性粒细胞激活被KYNA逆转

KYNA加入IC刺激的Ido1缺失中性粒细胞抑制其激活和铺展，60分钟时铺展细胞面积显著小于未处理细胞（p=0.041）。Western blot显示FcγR交联后60秒，Ido1缺失中性粒细胞Syk磷酸化快速强烈诱导，KYNA处理减弱此反应（p=0.001）。细胞因子检测显示，20种细胞因子中大多数低于检测限，VEGF和TNFα可稳定检测。第6小时Ido1缺失中性粒细胞VEGF分泌显著增加于WT，KYNA处理显著抑制此增加（p=0.008和p=0.038）。TNFα分泌无显著差异。

3.6 Kat2缺失加重NTS-GN蛋白尿

疾病诱导第14天，Kat2缺失小鼠肾皮质KYNA水平低于检测限，UACR显著高于WT（p=0.0073），血清肌酐水平相当。

讨论

本研究证明Ido1缺失在NTS-GN模型中加剧肾功能障碍和肾小球损伤。KYNA给药有效缓解了Ido1缺失引起的肾损伤和中性粒细胞失调，包括形态铺展、FcγR依赖性Syk信号和VEGF分泌，通过改变中性粒细胞功能显示治疗潜力。Ido2缺失对肾损伤无显著影响，Kmo缺失导致新月体形成减少。这些发现强调了TRP代谢的关键作用，特定代谢酶的不同贡献，并将KYNA定位为调节免疫反应和防止抗体介导性肾小球肾炎进展的有希望的治疗靶点。

表型观察和已报道的表达模式为这些差异提供了生物学背景。Ido1缺失显著加剧NTS-GN，伴随中性粒细胞激活增强。Ido1缺失的有害作用不仅通过受损的NAD合成介导，还通过TRP代谢物介导的中性粒细胞功能调节丧失。与此作用一致，Ido1在稳态条件下几乎检测不到，但在肾内皮细胞和免疫细胞（包括抗原呈递细胞和巨噬细胞）中被IFN-γ等炎症细胞因子强烈诱导，在中性粒细胞中也有表达。相比之下，Ido2缺失对疾病进展影响有限，反映其相对较弱的酶活性和表达模式。NTS-GN主要是中性粒细胞驱动模型，IDO2在B细胞和特定树突状细胞亚群中低表达，在肾近端小管细胞中有报道，但中性粒细胞中表达证据很少，与最小表型一致。Kmo缺失与新月体形成率降低相关。虽然先前研究表明Kmo缺失减轻缺血再灌注模型中的肾间质损伤，本研究提供证据表明KMO加重肾小球损伤。Kmo缺失小鼠肾组织中高浓度的KYN和KYNA可能有助于观察到的肾保护作用。

作为TRP途径的最终代谢物且对NAD合成无贡献，KYNA在我们的NTS-GN模型中表现出显著的肾保护作用。先前研究表明，KYN和3-HAA等犬尿氨酸途径代谢物具有免疫调节特性，包括抑制NK和促炎T细胞反应以及促进Th2和调节性T细胞。一些免疫效应由芳香烃受体（AhR）激活介导，AhR在先天和适应性免疫细胞中表达，KYNA本身已被报道激活AhR。此外，KYNA也是G蛋白偶联受体35的配体，其相互作用有助于减少LPS诱导的单核细胞和巨噬细胞炎症反应以及调节人iNKT细胞中的细胞因子释放。这些机制为KYNA在免疫介导疾病（包括抗体介导性肾小球肾炎）中的抗炎活性提供了合理解释。

基于这些发现，我们的研究新证明KYNA通过直接调节中性粒细胞反应保护 against肾小球损伤。在Ido1缺失小鼠中，NTS-GN早期观察到组织中性粒细胞浸润增加，表明它们在加剧肾损伤中的作用。此外，从Ido1缺失小鼠骨髓分离的中性粒细胞在体外显示向"铺展形式"的持续形态变化，伴随增强的FcγR–Syk磷酸化和增加的VEGF分泌，可能反映其高度激活状态。KYNA给药缓解了体内和体外异常，支持其抑制中性粒细胞驱动损伤的作用。机制上，KYNA可能通过AhR激活发挥此效应，另一AhR配体TCDD在二氧化硅诱导的肺损伤中抑制中性粒细胞浸润的报告支持这一点。此外，研究表明KYNA通过AhR激活增强TSG-6表达，结合我们的结果，表明KYNA可能通过此途径抑制中性粒细胞趋化。这些发现突出KYNA作为独特TRP代谢物，不仅通过广泛抗炎作用，还通过中性粒细胞调节机制赋予肾保护。

有趣的是，尽管缺乏功能性IDO1，Ido1缺失小鼠中KYNA水平增加。结合KYNA/KYN比的逐渐上升和未变化的3HAA/KYN比，这一发现表明KYNA生产可以以IDO1非依赖性方式增强。一个可能解释是在炎症条件下色氨酸代谢优先转向KYNA分支。这一机制可能解释Ido1缺失小鼠中观察到的矛盾KYNA升高，并进一步支持抗体介导性肾小球肾炎中TRP代谢的复杂性。

替代机制的额外分析未表明在此模型中的主要贡献。肾小球抗体沉积在基因型间和KYNA与PBS处理小鼠间相当，表明疾病严重程度差异不归因于改变的免疫复合物形成。我们还检查了巨噬细胞激活，因为先前研究将IDO与巨噬细胞功能联系起来。在我们的实验中，M1刺激后Ido1缺失和野生型小鼠的骨髓来源巨噬细胞显示相当的CD86诱导。与先前报告的差异可能反映使用骨髓来源而非腹膜巨噬细胞，或这些细胞可能不能完全再现体内组织驻留巨噬细胞的行为。因此，我们的结果不排除巨噬细胞的作用，而是表明中性粒细胞激活代表当前条件下更突出的机制。

本研究为进一步了解TRP代谢在肾脏病理进展中的作用提供见解。值得注意的是，KYNA表现出独立于NAD的独特抗炎效应，减轻NTS-GN。此外，虽然Ido1缺失加剧肾损伤，Ido2和Kmo缺失的影响揭示这些酶的 distinct作用，强调TRP代谢途径中酶的个体贡献。这些发现表明KYNA中心免疫调节策略作为有希望的治疗方法的潜力，不仅用于NTS-GN，还用于其他免疫介导疾病，特别是通过本研究证明的中性粒细胞调节。期待进一步研究阐明KYNA的分子机制及其潜在临床应用。