性别特异性代谢组学揭示妊娠期能量限制的持久影响及哺乳期肌醇补充的干预潜力

本研究通过代谢组学分析，揭示妊娠期热量限制（GCR）对后代成年代谢组的性别特异性影响，并证实哺乳期补充肌醇（myo-inositol）可逆转多数代谢紊乱。肌醇主要靶向雄性肝脏功能与雌性代谢调控，为早期营养干预提供新策略，强调性别差异化治疗的重要性。

　　

1 引言

妊娠期和哺乳期是发育的关键窗口期，对后代代谢编程具有深远影响。营养不良（包括营养过剩或不足）可能对后代产生终身不良后果。在西方化背景下，妊娠期体重过度增加需引起关注，但营养不良的影响同样显著，包括妊娠期进食障碍或饥荒等事件。动物模型中，产前营养不良导致成年后代肥胖和2型糖尿病倾向增加，尤其暴露于肥胖环境时更明显，这与下丘脑结构改变、脂肪组织和胃外周神经支配减少以及胰岛素和瘦素敏感性受损等有关。

除确保妊娠期充足营养外，最佳哺乳条件（如人类母乳喂养相比婴儿配方奶）具有保护作用，并可能逆转或减轻不良妊娠条件引起的改变。母乳中的生物活性成分如肌醇（myo-inositol）浓度高于商业婴儿配方奶，在动物模型中，哺乳期补充生理剂量肌醇具有神经营养作用，可逆转胎儿营养不良导致的程序性下丘脑结构改变，这一效应可能部分通过脑源性神经营养因子（BDNF）信号传导介导，且存在性别差异。肌醇还促进神经元连接发育，并在哺乳期补充后预防雄性大鼠因妊娠期热量限制（GCR）和后续肥胖饮食暴露导致的胰岛素抵抗和高甘油三酯血症。然而，更广泛的代谢组学影响尚不清楚，本研究通过代谢组学方法探讨肌醇补充对胎儿能量限制持久影响的保护机制。

2 结果

2.1 体重和生化参数

7月龄时体重、体成分和血液生化参数已发表。无论雄性还是雌性，母体条件或肌醇处理均未观察到体重或脂肪质量百分比差异。肌醇处理的雄性在自由采食条件下显示较低 homeostasis model assessment of insulin resistance（HOMA-IR）和甘油三酯水平。在雄性中，GCR增加 vehicle 处理动物的空腹胰岛素和甘油三酯水平，但肌醇处理者无此效应。雌性大鼠中，肌醇或GCR对胰岛素水平或HOMA-IR无显著影响，但肌醇处理增加热量限制雌性在自由采食条件下的甘油三酯水平。

2.2 鉴定出的代谢物和性别差异

对 vehicle 和肌醇处理的对照及妊娠期热量限制（C-V、C-Myo、CR-V、CR-Myo）雄性和雌性7月龄血浆样本进行非靶向代谢组学分析，鉴定出164种代谢物。主成分分析（PCA）显示基于性别的明显分离（成分1解释19.5%方差，成分2解释10.7%），相同性别内未观察到基于GCR或肌醇补充的明显聚类，但进一步分析发现个体代谢物差异。鉴于性别差异，所有分析均分性别进行。

2.3 妊娠期热量限制对 vehicle 处理成年血浆代谢组的影响

为评估GCR对后代成年代谢组的影响，并识别对照和妊娠期热量限制组之间最相关和区分性的血浆代谢物，我们对 vehicle 处理组（CR-V vs. C-V）分性别进行火山图分析和监督偏最小二乘判别分析（PLS-DA）。

在雄性中，火山图分析鉴定出9种代谢物在CR-V vs. C-V中过度表达：溶血磷脂酰胆碱（lysoPC (18:0)）、α-羟基异丁酸、胆红素、尸胺、异亮氨酸、L-鸟氨酸、lysoPC (O-18:0/0:0)、乳清酸和缬氨酸；10种代谢物低表达：2-氧代丁酸、组胺、咪唑丙酸（IMP）、苹果酸、中酒石酸、肌醇、丙酮酸、琥珀酸、尿嘧啶和尿苷。在雌性中，母体热量限制导致α-羟基异丁酸、胆碱、O-乙酰丝氨酸、琥珀酸和黄嘌呤核苷过度表达，而谷氨酰胺降低。

PLS-DA鉴定出区分两组实验组的VIP得分最高的前15种代谢物。雄性和雌性显示不同代谢物谱，但α-羟基异丁酸在两种性别中均突出，GCR暴露者水平增加。

2.4 哺乳期肌醇补充对对照动物成年血浆代谢组的影响

为评估哺乳期肌醇补充对对照动物成年血浆代谢组的影响，我们对C-V和C-Myo组进行火山图分析和监督PLS-DA。

火山图显示，哺乳期肌醇补充增加雄性胆红素和N-甲基脯氨酸水平，以及雌性瓜氨酸水平，同时降低雌性血清素水平。PLS-DA显示肌醇和 vehicle 处理动物明显分离。VIP得分图显示前15种代谢物。

2.5 哺乳期肌醇补充对妊娠期热量限制母鼠后代成年血浆代谢组的影响

肌醇处理在CR动物中正常化大多数受母体条件影响的代谢物（雄性19种中的16种，雌性6种全部）。仅胆红素、尸胺和乳清酸在CR-Myo和C-V组间保持显著差异。热图显示雄性和雌性血浆中C-V和CR-V组差异代谢物及其在CR-Myo组的潜在正常化。

相对血浆水平显示，GCR降低雄性尿苷水平（二因素ANOVA），以及IMP、丙酮酸和组胺水平（三因素ANOVA）， vehicle 处理雄性中更显著。GCR还导致 vehicle 处理雄性2-氧代丁酸、尿嘧啶、肌醇、苹果酸、琥珀酸和中酒石酸水平降低，但肌醇处理者无此效应。雌性中类似模式发现谷氨酰胺水平因GCR降低，但肌醇补充者水平恢复。

相反，GCR增加两性α-羟基异丁酸和lysoPC (18:0/0:0)水平，以及雄性尸胺、胆红素和乳清酸水平，但肌醇补充动物中不显著（尸胺除外），且单因素ANOVA事后检验提示GCR和肌醇对增加乳清酸水平有 additive 效应。GCR还增加雄性lysoPC (O-18:0/0:0)、异亮氨酸、L-鸟氨酸和缬氨酸水平，以及雌性黄嘌呤核苷、O-乙酰丝氨酸和胆碱水平，但肌醇处理者无此效应。GCR还增加雌性尿嘧啶和N-甲基脯氨酸水平，肌醇处理者效应更显著。

肌醇处理还增加雄性IMP水平，同时降低雄性和雌性血清素水平（后者仅对照），以及雌性琥珀酸水平。还增加雌性瓜氨酸水平和对照雄性胆红素和N-甲基脯氨酸水平，并降低GCR暴露雌性组氨酸水平。

2.5.1 代谢功能

考虑到代谢途径及其调控过程的复杂相互作用，我们构建了一个整合肌醇补充影响的所有生物功能的偏相关网络。生物功能及其评分基于组成代谢物的共同生物学角色，并使用线性PLS回归组合评分。该方法在生物模块水平评估集体显著性，允许通过相关网络研究模块相互作用，突出网络中具有显著连通性的关键功能，通过 betweenness centrality 系数识别。具有较高 betweenness centrality 的节点对网络动态影响更大， thus 对涉及代谢系统功能影响更大。

使用正态概率图选择具有 greater topological betweenness centrality 系数的节点。在雄性中，肌醇补充突出 several 相关功能，包括碳水化合物（CHO）代谢、肝脏功能、血管健康、一碳代谢、尿素循环、磷脂代谢和异生物质代谢。肝脏功能在随机森林分析中对准确分类 vehicle 或肌醇组个体最显著。

在雌性中，肠道功能和血管健康作为中心节点出现，具有最高 betweenness centrality 值，表明与肌醇响应其他功能强连接。此外，免疫功能、氨基酸和蛋白质代谢、胰岛素敏感性、CHO和一碳代谢是显著功能。代谢枢纽在随机森林模型中显示最高平均减少精度（MDA）值， thus 是基于肌醇补充将雌性分类到实验组的最佳功能。

3 讨论

母体妊娠期营养不良对后代发育产生负面影响，增加成年代谢改变风险。通过血浆样本全面代谢组学分析，我们揭示一组因GCR改变浓度的代谢物，提供机制见解。值得注意的是，代谢物数据来自血浆，反映系统代谢状态，因此 while 某些变化可能与细胞内途径活性一致，我们的解释谨慎限于循环代谢物谱和生物学角色范围内。此外，我们强调哺乳期肌醇补充减轻次优子宫内环境诱导 malprogramming 的潜力。

与我们之前发现类似，轻度/中度GCR对雄性后代 adverse 影响大于雌性，这里我们观察到雄性血浆代谢物显著改变数量更多（19 vs. 6），表明对雄性代谢影响更广。值得注意的是，肌醇补充在CR动物中正常化雄性19种中的16种和雌性全部6种代谢物。

值得注意的是，CR雄性显示肌醇水平降低，哺乳期肌醇补充防止此效应。这一降低与肌醇胰岛素增敏效应一致。较低肌醇水平可能 contribute to 这些动物 observed 胰岛素抵抗。在人类中，增加糖和精制碳水化合物摄入，以及胰岛素抵抗和糖尿病，与肌醇需求增加相关。因此，暴露西方饮食（WD）动物较低肌醇水平可能加剧代谢改变。哺乳期补充肌醇帮助正常化血浆水平和成年CR动物葡萄糖/胰岛素稳态。

一些在CR动物改变的代谢物与能量、中枢和CHO代谢相关。其中必须强调，降低血浆丙酮酸和三羧酸循环（TCA）中间体苹果酸和琥珀酸水平在雄性后代发现。虽然这些代谢物经典与细胞内途径如糖酵解和TCA循环相关，它们在血浆存在可能反映更广系统代谢改变，包括改变底物可用性、线粒体功能或组织水平代谢转移。丙酮酸水平降低可能指示减少糖酵解流，潜在影响线粒体功能。降低苹果酸和琥珀酸水平可能也反映TCA循环改变，以及葡萄糖和氨基酸代谢。琥珀酸也作为炎症信号分子，因此雌性GCR暴露 elevated 水平可能提示慢性炎症状态或微生物群失调。此外，GCR暴露雌性显示降低谷氨酰胺水平，其在蛋白质合成扮演角色并作为抗氧化剂谷胱甘肽前体，对细胞氧化还原平衡至关重要。谷氨酰胺也燃料TCA循环并 donate 氮用于嘌呤/嘧啶合成。血浆谷氨酰胺水平与炎症生物标志物 inverse 相关在干细胞移植后患者观察到，提示GCR可能诱导炎症状态。此外，雌性中GCR增加血浆黄嘌呤核苷水平提示潜在氧化应激影响， linked to 嘧啶和烟酰胺代谢改变，可能导致炎症和活性氧（ROS）生产。所有这些改变指示GCR detrimental 效应持续到成年，并可能反映能量代谢破坏。然而，雌性 case 中，无 discernible 经典生化参数改变 observed，提示代谢改变尚未在表型明显。重要的是，这些改变在哺乳期肌醇补充动物 absent。

关于氨基酸代谢，GCR增加血浆α-羟基异丁酸（也称2-羟基异丁酸（2-HIBA））水平在两性， vehicle 处理组更显著。哺乳期肌醇补充部分正常化这些水平。2-HIBA是亮氨酸降解产物，一种支链氨基酸（BCAA）。增加尿2-HIBA水平，在糖尿病II型小鼠（db/db模型）观察到，与BCAA降解途径破坏相关。一致地，这一代谢物 elevated 水平在肥胖患者和妊娠期糖尿病女性尿中观察到。增加血浆水平可能来自亮氨酸 catabolism 失调，主要发生在骨骼肌， lesser extent 在肝脏和脂肪组织。这一失调可能来自激素失衡、炎症或氧化应激 associated with 功能失调状态，干扰正常BCAA catabolism。这方面，也值得注意的是，增加血浆异亮氨酸和缬氨酸（其他BCAAs）水平在GCR暴露雄性，但哺乳期肌醇补充者无。

与磷脂代谢相关代谢物，如LPC(18:0/0:0)（LPC）和lysoPC (O-18:0/0:0)，也在CR动物改变，尤其雄性，潜在指示受损肝脏功能。有趣地，水平正常化（lysoPC (O-18:0/0:0)）或部分正常化（LPC (18:0/0:0)）在肌醇补充雄性大鼠。然而，炎症期间，过量LPCs可能 within OxLDL 运输，施加下游有害效应。它们也可能 undergo 进一步水解生产其他炎症介质。另一方面，lysoPC (O-18:0/0:0)，也称lyso-PAF C:18，因为它通过水解血小板活化因子（PAF）生成，已被建议 involved in 炎症过程。因此， elevated LPC和Lyso-PAF水平在CR雄性可能反映受损肝脏功能或成年炎症条件，肌醇补充可能 attenuate。

母体条件潜在改变肝脏功能的另一证据，尤其雄性，是增加血浆乳清酸（OA）水平，嘧啶生物合成中间体，和胆红素，肌醇补充未逆转。 elevated OA水平典型发现尿素循环酶缺陷患者。此类 cases，过量氨甲酰磷酸积累在线粒体基质，移动到胞质，并用于OA生产。此外，增加血浆OA水平可能来自嘧啶合成错误影响UMP合成或因素阻止其转化到UMP和其他嘧啶。这些条件可能导致OA build-up。因此， de novo UMP合成限制，UMP和其他嘧啶生产可能通过 salvage 途径回收尿苷补偿，与CR雄性 observed 较低尿苷水平一致。

OA积累在CR雄性可能 adversely 影响肝脏功能，触发细胞内脂质积累。事实上，OA常用诱导大鼠脂肪肝疾病。OA负调控肝脏肉碱 palmitoyltransferase 表达并正调控脂肪酸合酶，潜在改变肝脏脂肪酸代谢。此外，也与肝脏功能和嘧啶代谢相关，CR动物，尤其雄性，显示较高血浆胆红素水平，血红素代谢自然终产物。胆红素解毒在肝脏涉及UDP-葡萄糖醛酸，从UMP形成。减少UMP从OA形成可能 contribute to 增加血浆胆红素水平，因为胆红素解毒在肝脏依赖UDP-葡萄糖醛酸，来自UMP。母体热量限制与增加血浆胆红素水平在成年雄性大鼠相关，与代谢功能障碍相关脂肪肝疾病（MASLD） linked。然而，新兴证据指示血清胆红素展示抗炎、抗氧化和免疫抑制特性，人类研究显示胆红素水平与代谢疾病（心血管疾病、高血压、糖尿病、代谢综合征和肥胖） inverse 相关。因此，增加胆红素水平可能 counteract adverse 编程效应在这些动物。这一支持通过观察增加胆红素水平响应母体热量限制和肌醇补充在对照雄性。因此， elevated 胆红素在肌醇处理雄性动物可能增强抗氧化响应，减轻炎症和氧化应激 induced by WD喂养在成年。必须强调，所有代谢物测量在血浆进行，非细胞内水平。因此， while 血浆代谢物变化可能反映系统生理或代谢改变，它们不允许直接推断细胞内生化过程。

IMP显示相反效应在雄性由于母体热量限制和肌醇处理。 While GCR降低IMP水平，肌醇增加它们。IMP是组氨酸代谢物由肠道 microbiota 合成， elevated 浓度与肠道炎症和条件如CVD和糖尿病 linked。然而，最近研究突出其抗炎效应，调控线粒体功能和ROS生产，潜在减轻GCR诱导炎症。

我们使用多块分析调查肌醇补充机制效应，揭示CHO代谢作为中心功能在雄性。这突出其显著角色在响应肌醇补充，与肌醇已知增强外周组织胰岛素敏感性能力一致。我们的分析揭示CHO代谢途径直接与葡萄糖/胰岛素稳态过程相互作用，包括肝脏功能、TCA、表观遗传修改和一碳代谢。此外，随机森林分析鉴定肝脏功能作为最显著因素在分类个体基于哺乳期肌醇补充， underscore 其中心性 within 网络 alongside CHO代谢。给定强肝脏-代谢物相互作用，肝脏功能出现 crucial 在代谢响应肌醇，一致研究证明肌醇角色在改善肝脏功能和代谢疾病标志物在肥胖患者非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）。

在雌性，相关网络分析揭示肠道功能具有最高中心性， closely linked to CHO代谢、TCA、一氧化氮代谢和血管健康，尽管较少互连。这些发现与肌醇对胰岛素敏感性无表观效应在雌性一致，可能 related to 它们更大韧性对肥胖饮食。然而，我们观察微妙变化在代谢物如血清素、瓜氨酸和琥珀酸。值得注意的是，代谢枢纽出现最有影响力功能在分类个体基于肌醇补充在随机森林分析。

总之，我们的研究阐明GCR持久效应， intensified by 暴露肥胖饮食在成年，对后代血浆代谢组，同时 highlight 哺乳期肌醇补充减轻这些效应的潜力。更大 affected 代谢物数量在成年雄性后代相比雌性提示GCR有更显著影响代谢过程在雄性， linked to 更 pronounced adverse 表型效应。代谢物水平改变 resulting from GCR提示促炎条件、氧化应激和受损肝脏功能在成年，尤其雄性，肌醇主要影响代谢物 associated with 肝脏功能和碳水化合物代谢。这些变化可能 linked to 改善胰岛素敏感性 attributed to 肌醇。 divergent 代谢组学响应 between 雄性和雌性 emphasize 需要性别定制方法在早期生命营养干预。

4 实验部分

4.1 动物和实验设计

动物协议由巴利阿里大学生物伦理委员会批准（决议号2018/13/AEXP）并遵循大学实验室动物护理和使用指南。

本研究使用相同动物队列作为之前研究。简要，处女Wistar雌鼠与雄鼠交配后分成两组：对照母鼠（C-dams），自由获取标准 chow 饮食（SD；3.3 kcal·g^?1，8.0%卡路里来自脂肪；Panlab, Barcelona, Spain）和热量限制母鼠（CR-dams），从妊娠第1到12天 subjected to 25%热量限制。整个哺乳期，C-和CR-dams后代（称C和CR动物）接受每日口服剂量肌醇（C-Myo和CR-Myo）或 vehicle（水）（C-V和CR-V）。动物维持标准 chow 饮食直到5月龄，之后移动到高脂高蔗糖饮食（西方饮食，WD；4.7 kcal·g^?1，40.0%卡路里来自脂肪，43.0%来自碳水化合物，17.0%来自蛋白质；Research Diets, New Brunswick, USA）2个月。7月龄时，雄性和雌性在自由采食条件下通过断头处死。血液样本收集在肝素化容器，血浆通过离心获得并存储?80°C直到分析。代谢组学分析在血浆样本进行如支持信息方法详细。

4.2 剂量信息

肌醇（Sigma-Aldrich）口服给药整个哺乳期。每日剂量设为平均从母奶摄入量两倍，基于其在对照母鼠浓度（0.426 mg/mL）和估计幼崽奶摄入（范围从0.5 mL在第1天到11.88 mL在第20天）。这导致每日肌醇剂量范围从0.43到10.12 mg超过20天 period。

4.3 代谢组学分析

为减轻固有分析变异性在准备和分析，所有组样本最初随机化并准备在两个不同批次。

4.3.1 干燥提取物准备

血浆样本（100 μL）蛋白质沉淀用400 μL冷甲醇（?20°C）。样本 subjected to 涡旋 agitation 1 min并随后孵化在?20°C 1 h。之后，离心进行在4°C 15 min在11 000 rpm，上清小心收集。上清然后收集在10 KDa离心过滤器（VWR, Rosny-sous-Bois, France）并离心第二次在4°C 45 min在11 000 rpm。上清收集并干燥 under 氮气流在?80°C直到分析。所有血浆干燥提取物重构用125 μL乙腈/水（90:10; v:v）0.1%甲酸为HILIC柱或125 μL乙腈/水（10:90; v:v）0.1%甲酸为C18柱。样本涡旋1 min然后收集在45 μm离心过滤器（VWR, Rosny-sous-Bois, France）并离心如之前过滤。总共70 μL上清转移进小瓶为后续分析。

4.3.2 质量控制（QC）和空白

为保证鲁棒重复性在分析，质量控制样本（QC）生成通过结合小等分从每个生物样本以及系列QC稀释（10, 100, 1000）。QC样本，由小等分实验样本组成， undergo 间歇分析，频率为每五样本一次， throughout 整个分析研究 duration。系列稀释分析一次在分析系列开始。QC分析 facilitate 评估固有方差在数据 across 连续阶段， encompassing 样本准备、数据获取和数据预处理。串联质谱，也称MS/MS，实验 additionally 进行在QC样本 towards 序列结束， aiming 增强代谢物注释通过比较MS/MS谱与我们内部数据库引用 over 800化合物。此外，提取空白溶剂混合物准备在同一时间作为生物样本。这一提取空白分析在实验序列 onset。

4.3.3 液相色谱质谱分析

样本分离 employing Vanquish超高效液相色谱（UPLC）系统（Thermo Scientific, Illkirch, France）连接Orbitrap Exploris 240质谱仪带OptaMax加热电喷雾电离源（H-ESI II）。

色谱分离进行用两种类型柱以增强代谢组覆盖范围。为反相色谱，使用Hypersil Gold C18柱100 mm × 2.1 mm, 1.9 μm（Thermo Scientific, Illkirch, France）带流动相 consisting of 组合溶剂A（0.1%甲酸在水中，v/v）和溶剂B（0.1%甲酸在乙腈，v/v）在流速0.4 mL·min^?1和柱温40°C。梯度开始0到1 min，等度100% A；1到11 min，线性从0%到100% B；11到13 min，等度100% B；13到14 min，线性从100%到0% B；14到16 min，等度100% A。

为亲水相互作用色谱（HILIC），使用SeQuant ZIC-HILIC柱150 mm × 2.1 mm, 5 μm, 200 A（Merck Millipore, MA, EE. UU.）在25°C和流速0.25 mL·min^?1。流动相 consisting of 组合溶剂A（100%水，16 mM甲酸铵）和溶剂B（100%乙腈，0.1%甲酸）。以下梯度条件使用：0到2 min，等度97% B；2到10 min，线性从97%到70% B；10到15 min，线性从70%到10% B；15到17 min，等度10% B；17到18 min，线性从10%到97% B；18到22 min，等度97% B。注射体积为两种柱5 μL。

分离分子检查使用 both 正和负电离模式 used 同时 in 切换模式 within 单次分析运行。LC/MS获取后，全扫描—MS1在 both 正和负模式—原始数据文件收集使用分辨力70 000半峰全宽（FWHM）在理论质荷比（m/z）200。

电离源参数为正和负离子模式如下：毛细管温度320°C，喷雾电压3.5 kV，鞘气30（任意单位），辅助气8（任意单位），汽化器温度200°C，射频透镜60%。MS/MS实验进行使用高能碰撞诱导解离（HCD），应用归一化碰撞能量（NCE）斜坡从15%到45%。

4.3.4 数据处理和分子鉴定

LC/MS获取后，原始数据文件从全扫描，覆盖MS1在 both 正和负模式，转换到mzXML文件。数据转换使用MsConvert 64 bites（Proteowizard, Palo Alto, CA, USA）生成数据矩阵去卷积离子带m/z、保留时间（RT）和强度使用MZMine 2.3.2。这涉及提取化学噪声（噪声水平设到1.0E4为HILIC柱和1.5E4为C18柱），移除差积分峰（最小组大小5扫描，强度阈值7.5E4，最小最高强度1.0E5，和扫描到扫描精度5 ppm），进行对齐（m/z公差5 ppm，m/z权重75，RT公差0.1 min，RT权重25，和迁移率权重1.000）和抑制点从空白。

一旦原始数据矩阵创建，过滤过程实施消除变量 exhibiting 弱提取离子色谱图（EIC），次优峰形，和空白强度等于或大于那些 observed 在生物样本数据。分析漂移监控使用PCA分析 both QC和实验样本并纠正使用线性方法描述由Van der Kloet等。漂移纠正后，特征 exhibiting 变异系数 over 30%和那些不相关到对应特征在系列QC稀释样本丢弃。

关于代谢物注释，所有检测离子注释或鉴定使用内部数据库 comprising 约1300参考化合物，特定为每个代谢组分析方法 and 每个分子，带对应准确m/z、RT、公式和碎片谱。实验确定m/z和RT值匹配 against 内部数据库，确保质量误差小于5 ppm和RT差异小于0.5 min， employing Galaxy内部数据银行工具在Workflow4Metabolomics协作门户（W4M）。此外，为确保准确代谢物注释，建议信号从 both 色谱柱和 both 电离模式彻底检查。准确m/z和RT，MS/MS谱比较与标准MS/MS谱，相关 between 不同加合物，和峰强度在MS/MS考虑。注释代谢物详细随它们原始强度值在补充材料1。生物学角色为每个注释代谢物确定使用数据从人类代谢组数据库（HMDB）和PubChem描述。额外见解从PubMed出版物 incorporated whenever 可访问。

4.4 统计分析

数据表示为均值±SEM。特征从 both 电离模式—为HILIC和C18数据—统一进单数据集。代谢物强度归一化使用概率商归一化以确保准确数据比较 among 组。因此，分析进行使用SIMCA 12（Umetrics, Umea, Sweden）。相同预处理方法一致使用 across 所有PCA分析。简要，所有数据均值中心，除，和归一化 by 每个变量标准差使用自动缩放模式。主成分分析（PCA）进行，如 stated above，使用SIMCA 12。相同动物队列，包括 both 雄性和雌性，分析在所有PCA表示。 distinction between 这些图 lies in 变量 used for 颜色编码：Figure 1A颜色编码 by 性别，Figure 1B by GCR，和Figure 1C by 肌醇补充。这一致方法 enabled 我们可视化影响每个实验条件对样本聚类 within 统一数据集。加载变量为主成分1和2从PCA分析提供在Table S1。

进一步统计分析，包括火山图和偏最小二乘判别分析（PLS-DA），进行使用在线工具MetaboAnalyst 6.